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Protein-Lokalisierung

Immun-SERS-Mikroskopie zur Protein-Lokalisierung

| Autor/ Redakteur: Sebastian Schlücker* / Marc Platthaus

Immunhistochemie und Immunfluoreszenz sind etablierte Techniken zur Protein-Lokalisierung in Zellen und Geweben. Die Immun-SERS-Mikroskopie ist eine sehr aussichtsreiche neue Methodik mit Potenzial zur Vielfarbendetektion und Quantifizierung.

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Abb. 1 Grundprinzip der Immunhistochemie zur Lokalisierung von Antigenen wie Proteinen in Geweben. Neben dem Target liegen weitere immobilisierte Antigene im Gewebeschnitt vor. Die Lokalisierung des Targets erfolgt über das Marker-Signal im Antigen-Antikörper-Komplex.
Abb. 1 Grundprinzip der Immunhistochemie zur Lokalisierung von Antigenen wie Proteinen in Geweben. Neben dem Target liegen weitere immobilisierte Antigene im Gewebeschnitt vor. Die Lokalisierung des Targets erfolgt über das Marker-Signal im Antigen-Antikörper-Komplex.
( Archiv: Vogel Business Media )

Unter Immunhistochemie versteht man die Lokalisierung von Antigenen wie Proteinen in Geweben mithilfe markierter Antikörper. Das Grundprinzip der Immunhistochemie ist schematisch in Abbildung 1 gezeigt. Neben dem nachzuweisenden Zielmolekül, dem Target, liegen weitere immobilisierte Antigene im Gewebe vor.

Der selektive Nachweis des Targets erfolgt mithilfe eines Target-spezifischen markierten Antikörpers. Dabei wird die Selektivität der Erkennung zwischen Antigen und Antikörper ausgenutzt: der Antikörper bindet selektiv an das passende Antigen unter Ausbildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes. Nach dem Aufbringen des markierten Antikörpers werden nicht gebundene markierte Antikörpermoleküle durch Waschen entfernt. Die Lokalisierung des Targets im Gewebe erfolgt über den Marker, welcher direkt an den Antikörper gebunden ist. Das charakteristische Signal des Markers liefert so die Information über das Vorliegen des Zielmoleküls.

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In Anwendungsgebieten wie der Pathologie wird die Immunhistochemie als Standardverfahren zur Diagnostik eingesetzt. Routinemäßig wird dabei zumeist auf ein bestimmtes Zielprotein oder Target getestet. Durch den Übergang zum Multiplexing (Nachweis mehrerer Zielmoleküle) lassen sich die Möglichkeiten der Immunhistochemie enorm erweitern.

Antikörper-Markierung für die optische Detektion

Die verschiedenen Ansätze zur Markierung für die optische Detektion besitzen ein sehr unterschiedliches Multiplexing-Potenzial für den Nachweis mehrerer Zielmoleküle. Dieser Sachverhalt ist in Tabelle 1 dargestellt: neben dem Marker ist auch der jeweils zugrunde liegende physikalisch-chemische Prozess aufgeführt. Eine Möglichkeit zur Markierung von Antikörpern sind Farbstoffe, welche direkt lichtmikroskopisch beobachtet werden können (Tab. 1 links); sichtbar ist die Komplementärfarbe des jeweils absorbierten Lichtes. Um gleichzeitig mehrere Antigene zu lokalisieren, müssen die passenden Antikörper mit optisch unterscheidbaren Markern versehen werden. In der Fluoreszenz-Mikroskopie werden hierzu Fluorophore verwendet. Diese zeigen nach Anregung mit Licht passender Wellenlänge eine charakteristische Fluoreszenz-Emission. Sind die Emissions-Signale spektral getrennt, so können mehrere Fluorophore nebeneinander detektiert werden. In der Immunfluoreszenz lassen sich so typischerweise drei verschiedene Marker gleichzeitig nebeneinander nachweisen (Tab. 1 Mitte). Bei einer höheren Anzahl von Markern überlagern deren Fluoreszenz-Signale, sodass die eindeutige Zuordnung der Beiträge schwierig oder nicht möglich ist. Die neuere Technologie der Quantendots erlaubt den Nachweis von etwa 3 bis zehn Markern (Tab. 1 Mitte); sie stellt somit gegenüber konventionellen Fluorophoren bereits eine deutliche Verbesserung dar, kann aber bei weitem nicht mit dem Potenzial der Raman-Spektroskopie konkurrieren (Tab. 1 rechts). Die hier auftretenden Linienbreiten sind, da es sich um Schwingungsübergänge handelt, um etwa zwei Größenordnungen geringer als bei konventionellen organischen Fluorophoren. Daher können bis zu 100 verschiedene Raman-Marker simultan nebeneinander nachgewiesen werden.

Die schematische Struktur eines Raman/SERS-markierten Antikörpers ist in Abbildung 2a gezeigt. Der Antikörper ist über eine Amidbindung an den Raman-Marker gebunden, der seinerseits kovalent an ein Nanopartikel aus Gold oder Silber konjugiert ist. Die Einheit aus Raman-Marker und Goldnanopartikel dient der optischen Detektion über Oberflächen-verstärkte Raman-Streuung. In Abbildung 2b ist die Farbe einer kolloidalen Lösung von Goldnanopartikeln, welche an Raman-markierte Antikörper gebunden sind, gezeigt.

Signatur von Raman- und SERS-Markern

Wie in der Fluoreszenz-Mikroskopie erfolgt auch in der Raman- und SERS-Mikroskopie die Signalerzeugung mithilfe von Laseranregung. In der Immun-SERS-Mikroskopie (SERS, surface-enhanced Raman scattering) müssen die Lichtabsorption der Nanopartikel (s. Abb. 2a) und die verwendete Laserwellenlänge aufeinander abgestimmt sein. Die Farbe der kolloidalen Lösung (s. Abb. 2b) lässt sich durch Parameter wie Größe und Form der Nanopartikel kontrollieren. Die Anregung von sog. Plasmonen durch das eingestrahlte Laserlicht führt zu einer drastischen Verstärkung des elektromagnetischen Feldes an der Nanopartikeloberfläche: hierdurch wird die Intensität der Raman-Streuung des Markers um mehrere Größenordnungen verstärkt. SERS-Spektroskopie und -Mikroskopie vereinen somit die Vorteile der Raman-Streuung mit einer sehr hohen Sensitivität.

Abbildung 3 zeigt das Raman/SERS-Spektrum eines Raman/SERS-markierten Antikörpers (vgl. Abb. 2a): alle Banden lassen sich – analog zur Infrarot (IR)-Absorptionsspektroskopie – funktionellen Gruppen der Raman-Markereinheit zuordnen. Aufgrund der Abstandabhängigkeit des SERS-Effektes werden nur spektrale Beiträge des an der Oberfläche befindlichen Raman-Markers, nicht aber des weiter von der Oberfläche entfernten Antikörpers, beobachtet. Eine alternative graphische Darstellung eines Raman/SERS-Spektrums sind Strichcodes, in denen die Position und die Intensität jeder Raman-Bande kodiert dargestellt sind. Um die Eindeutigkeit für jedes Paar aus Antikörper und Raman-Marker sicherzustellen, muss jede Markereinheit einen ganz charakteristischen Strichcode aufweisen. Dies lässt sich durch chemische Variation des Raman-Markers erzielen. Es wird erwartet, dass in den nächsten Jahren zehn bis zwanzig verschiedene Raman-Marker mit unterschiedlichen Strichcodes zur Verfügung stehen werden. Theoretisch können sogar bis zu 100 verschiedene Targets/Zielmoleküle simultan nachgewiesen werden.

Kombination von Raman-Spektroskopie und Licht-Mikroskopie

Raman-Mikroskopie (auch Raman-Mikrospektroskopie genannt) ist die Kombination von Raman-Spektroskopie und Lichtmikroskopie. Hiermit können Raman-Spektren von kleinsten Probenmengen aufgenommen werden; in Kombination mit einer ortsaufgelösten Detektion ist die Raman-Mikroskopie daher ein sehr vielseitiges Werkzeug der chemisch-spektroskopischen Bildgebung. Als SERS-Mikroskopie wird die Detektion von SERS-Signalen eines Markers (Reagenz) mithilfe eines Raman-Mikroskopes (Gerät) bezeichnet. Die Immun-SERS-Mikroskopie ist somit eine Variante der SERS-Mikroskopie. In diesem speziellen Fall werden Antikörper mit Raman/SERS-Markern konjugiert. Die erste Demonstration der Immun-SERS-Mikroskopie erfolgte anhand der Lokalisierung des Prostata-spezifischen Antigens (PSA) in Prostata-Gewebeschnitten. Dazu wurde ein PSA-Antikörper mit einem aromatischen Disulfid als Raman-Marker und Gold-Hohlkugeln für die Laseranregung im roten Spektralbereich eingesetzt. In Abbildung 4 ist links das Weißlichtmikroskopbild eines ungefärbten Prostata-Gewebeschnittes gezeigt. Histologisch lassen sich verschiedene Regionen unterscheiden: Epithel, Stroma, Bindegewebe und das Lumen. Nur im Epithel kommt PSA vor, während Stroma als auch Lumen kein PSA enthalten. Sie dienen daher beide als Kontrolle. Die Information über das Vorliegen bzw. Fehlen von PSA im jeweiligen Gewebetyp ist für den Proof of principle der Methodik eine essenzielle Information: nur im Epithel sind Beiträge des PSA-Raman-Markers zu erwarten. Ein im Epithel aufgenommenes Raman/SERS-Spektrum ist in Abbildung 4 rechts gezeigt: es weist die charakteristischen Beiträge des Raman/SERS-Markers auf (Abb. 2 bzw. 3). Im PSA-negativen Stroma werden diese Beiträge dagegen nicht beobachtet, sondern es tritt nur die native Gewebefluoreszenz auf. Das als weitere Kontrolle dienende Lumen weist lediglich Beiträge des Glas-Substrates auf, da hier kein Gewebe vorhanden ist.

Wohin führt der Weg der Immun-SERS-Mikroskpie?

Die in Abbildung 4 gezeigten Raman/SERS-Spektren wurden an einzelnen Positionen im Gewebe detektiert. Über sog. Mapping-Experimente, d.h. ein Abrastern des Schnittes entlang beider Raumkoordinaten, kann an jeder Position das dazugehörige Raman/SERS-Spektrum aufgenommen werden. Mithilfe entsprechender Software kann aus diesen bildgebenden Datensätzen die Verteilung des Markers über die jeweiligen Raman-Intensitäten ermittelt werden. Man erhält somit ein chemisches Bild, welches die Konzentrationsverteilung des Targets innerhalb des Gewebeschnittes reflektiert. Setzt man n verschiedene Marker simultan ein, so erhält man n chemische Bilder. Abbildung 5 zeigt dies für den Fall von 15 verschiedenen Markern. Von der simultanen und quantitativen Erfassung einer ganzen Reihe von Zielmolekülen versprechen wir uns deutliche Fortschritte hinsichtlich einer verbesserten Diagnostik. Raman/SERS-Marker können prinzipiell in fast allen Bereichen anstelle von Fluorophoren zur Markierung eingesetzt werden. Aufgrund der inelastischen Lichtstreuung kommt es zu keinem Photobleichen der Probe, sodass man diese mehrmals hintereinander vermessen und auch lagern kann. Zudem wird für die Anregung des Raman-Spektrums aller Marker nur eine einzige Laserquelle benötigt. Arbeitet man mit Nahinfrarot-Anregung, so lässt sich durch die Minimierung der Autofluoreszenz des Gewebes ein sehr hoher chemischer Bildkontrast erzielen. Raman/SERS-Marker wurden auch bereits in Immuno-Assays für den Proteinnachweis in Lösung eingesetzt, und es sind zahlreiche weitere Anwendungen dieser innovativen und hochsensitiven Raman-Technologie in den nächsten Jahren zu erwarten.

Hintergrund: Plamonen – Schwingungen des freien Elektronengases

Ein einfaches Modell von Metallen basiert auf der Vorstellung eines freien Elektronengases und einem positiv geladenen Metallrumpf. Als Plasmonen bezeichnet man die Anregung von kollektiven Schwingungen des freien Elektronengases. Bei Edelmetallnanopartikeln bestimmter Größe kann sichtbares Laserlicht zur Anregung von Plasmonen verwendet werden. Dieses nutzt man in der Oberflächenverstärkten Raman-Spektroskopie (s. Textkasten zu SERS) aus.

Hintergrund SERS – Oberflächen-verstärkte Raman-Streuung

SERS ist das Akronym für Surface-Enhanced Raman Scattering (Oberflächen-verstärkte Raman-Streuung). Dabei handelt es sich um eine hochsensitive Variante der Raman-Streuung, die man für Moleküle nahe von Metallnanostrukturen beobachtet. Die Intensität des Raman-Signals wird um mehrere Größenordnungen verstärkt. Der SERS-Effekt wurde erstmals in den 1970er Jahren an Pyridin auf aufgerauten Silberoberflächen beobachtet. Die vollständige Interpretation des SERS-Effektes ist nicht abgeschlossen, sondern Gegenstand intensiver aktueller Forschung.

Literatur:

[1] Buch zur IR- und Raman-Spektroskopie: B. Schrader, Infrared and Raman Spectroscopy, Methods and Applications; VCH: Weinheim, 1995.

*Institut für Physikalische Chemie, Julius-Maximilians-Universität Würzburg, 97074 Würzburg

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