Multiple Plate Analysis Software Integration von Real-Time-PCR-Studien mithilfe der Multiple Plate Analysis Software

Um die Nutzung und statistische Analyse von Daten umfangreicher Genexpressions- und Genotypisierungsstudien zu optimieren, werden neue Software-Tools benötigt. Für den LightCycler 480 steht jetzt eine Software zur Verfügung, die die Erstellung großer Datensätze aus mehreren Analyseläufen stark verbessert und beschleunigt.

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Die Real-Time-PCR hat sich zu einem molekularbiologischen Standardwerkzeug für die Analyse der mRNA-Expression unter verschiedenen physiologischen Bedingungen entwickelt. Sie ist darüber hinaus hervorragend geeignet zur schnellen und exakten Genotypisierung einzelner SNPs (single nucleotide polymorphisms) bei großen Probenzahlen ohne zusätzliche Bearbeitungsschritte. Da die Real-Time-PCR oft zur Validierung von Ergebnissen verwendet wird, die mit genomweiten Genexpressions- oder Genotypisierungsstudien gewonnen wurden (z.B. Microarray-Daten), haben Umfang und Größe der Untersuchungen in den letzten Jahren deutlich zugenommen. Die für Real-Time-PCR-Geräte erhältliche Software war bisher vor allem für die Interpretation von Rohdaten ausgelegt und unterstützt häufig nur die Auswertung einzelner PCR-Läufe. Um alle Daten zur Auswertung in Tabellenkalkulationsprogrammen oder einem anderen Computerprogramm zusammenzufassen, sind in der Regel viele zeitaufwändige Export/Import- oder Copy/Paste-Operationen notwendig – ein fehleranfälliger Prozess, der Datensicherheit und korrekte Zuordnung gefährdet. Dieser Artikel beschreibt die Anwendung der neuen LightCycler-480-Multiple-Plate-Analysis-Software für Genexpressions- und SNP-Geno/Haplotypisierungsstudien in der medizinischen Forschung.

Ablauf einer LightCycler 480 Multiple Plate Analysis

Zunächst wurden Genexpressions- und Genotypisierungsexperimente mit dem LightCycler 480 durchgeführt und mit den jeweiligen Modulen der LightCycler-480-Software 1.5 analysiert. Um eine spätere Analyse mit der LightCycler-480-Multiple-Plate-Analysis-Software zu erlauben, wurden die Dateien und Proben entsprechend gestaltet (Namen, Probentyp usw.). Die Ergebnisse der einzelnen Experimente mit den Analysedaten wurden aus der LightCycler-480-Datenbank als IXO-Dateien exportiert (einzeln oder als Batch) und in die LightCycler-480-Multiple-Plate-Analysis-Software importiert. Die Software enthält Bearbeitungsroutinen für alle vom LightCycler-480-System unterstützen Real-Time-PCR-Anwendungen, zum Beispiel absolute oder relative Quantifizierung, Geno- und Haplotypisierung oder Gene Scanning (s. Abb. 1).

Als erster Schritt der Bearbeitungsroutine wird ein Untersuchungsobjekt (Study Object) erstellt, dem die importierten IXO-Dateien zugeordnet werden. Für die spätere Analyse werden die zu untersuchenden Merkmale definiert, zusammen mit den verschiedenen Werten dieser Merkmale, die das Untersuchungsobjekt annehmen kann (siehe folgende Beispiele). Jede Probe wird dem entsprechenden Wert jedes Merkmals zugewiesen. Schließlich werden die Bearbeitungsroutine und das entsprechende Datenformat gewählt. Für alle der Studie zugewiesenen IXO-Dateien werden die gewünschten Analysemodule ausgewählt. Anschließend wird eine neue Analyse erstellt. Dabei wird eine Datei (im XLS-Format) erstellt, die alle mit den Daten assoziierten Informationen enthält und sich automatisch öffnet. Aufwändige Copy/Paste-Operationen sind nicht notwendig, Übertragungsfehler werden ausgeschlossen. Verschiedene implementierte Makros erlauben die einfache Analyse der Daten.

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