Integration von Real-Time-PCR-Studien mithilfe der Multiple Plate Analysis Software

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Praxisbeispiel 1: Relative Quantifizierung spezifischer mRNAs

In einem ersten Ansatz wurde die Expression von 16 mRNA-Transkripten untersucht, die als Kandidaten zur Vorhersage des Stadiums einer spinocerebellären Ataxie vom Typ 1 oder 3 (SCA1, SCA3) in Frage kamen [1,2]. SCA1 und SCA3 sind zwei autosomal-dominant vererbte neurodegenerative Erkrankungen. Diese Transkripte waren durch vorangegangene Microarray-Experimente gefunden worden. Für alle 16 mRNAs wurden Real-Time-PCR-Reaktionen mithilfe der Universal ProbeLibrary entworfen. Proben von 27 Versuchspersonen wurden auf die Expression dieser mRNAs und drei Referenzgene untersucht.

Für die Studie wurden die Proben abhängig vom Krankheitsstadium in die Gruppen „leicht“, „mäßig“ und „schwer“ unterteilt. Zwei Merkmale (Krankheitstyp und Krankheitsstadium) mit zwei bzw. drei möglichen Werten wurden so definiert. Als Bearbeitungsroutine diente „RelQuant Summary“. Zur Analyse wurden die normalisierten Expressionsverhältnisse (normalized ratios) verwendet.

In der von der LightCycler-480-Multiple-Plate-Analysis-Software erzeugten XLS-Datei werden im Tabellenblatt „Summary“ die normalisierten Expressionsverhältnisse mit Standardabweichungen für alle Analyseläufe und alle Proben zusammen mit ihren Eigenschaften dargestellt.

Zur Überprüfung und Visualisierung der verschiedenen Analyseläufe sind mehrere Möglichkeiten verfügbar: Die Werteverteilungen der einzelnen qRT-PCR Targets können zum Beispiel als Box-Plot dargestellt werden. Das Diagramm kann nach jeder Kombination von Merkmal und Wert gefiltert werden, was eine einfache Überprüfung des Wertebereichs und der Variabilität der Expressionsverhältnisse innerhalb der Mitglieder einer Gruppe, zum Beispiel eines Krankheitstyps oder Krankheitsstadiums, ermöglicht (s. Abb. 2 a/b).

Die häufigste Frage, die mit einem Real-Time-Experiment beantwortet werden soll, ist, ob die Expression eines Transkripts unter zwei oder mehreren Bedingungen unterschiedlich ist. Diese Frage wird im Tabellenblatt „Criteria Comparison“ (Kriterienvergleich) behandelt (Abb. 2 c/d): Für jede Analyse wird für jeden Wert des ausgewählten Merkmals das mittlere Expressionsverhältnis mit Standardabweichung berechnet und in Tabellenform dargestellt. Die Werte werden für eine grafische Darstellung in Form eines Balkendiagramms verwendet. Wurden die Daten mehr als einem Merkmal zugeordnet, konnte ein zusätzlicher Filter angewendet werden, um die Ergebnisse für jedes Merkmal separat darzustellen (Abb. 2 c/d). Um zu überprüfen, ob die beobachteten Unterschiede zufallsbedingt sein können, wurde für jede Wertekombination des ausgewählten Merkmals ein zweiseiter t-Test durchgeführt, auf Basis der Filterkombination im Kriterienvergleich. Hiermit konnten die im Microarray-Experiment gefundenen signifikanten Veränderungen für zwölf der 16 Transkripte direkt bestätigt werden (Daten nicht gezeigt). Für weitergehende statistische Analysen können die berechneten Mittelwerte und Standardabweichungen oder die Summary-Tabelle mit den normalisierten Expressionsverhältnissen einfach exportiert und mit Spezialsoftware bearbeitet werden.

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