Integration von Real-Time-PCR-Studien mithilfe der Multiple Plate Analysis Software

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Praxisbeispiel 2: Genotypisierung und Haplotypisierung

Die Komponenten der LightCycler-480-Multiple-Plate-Analysis-Software zur Analyse der genetischen Variabilität enthalten Funktionen zur Haplotyp- und Genotypzählung. So lassen sich aus den mit der Gerätesoftware erstellten Zuordnungen schnell Häufigkeiten und Verteilungen einzelner SNPs oder von SNP-Kombinationen darstellen. Um die Anwendbarkeit dieser Funktion im Rahmen einer ausgedehnten Humanstudie zum Rauchverhalten zu testen, wurden HybProbe-Sonden zur Genotypisierung von fünf benachbarten tag-SNPs im Gen für den Dopamin-D3-Rezeptor bei 488 Personen benutzt [3, 4]. Alle Genotypen wurden mit der Genotypisierungssoftware des LightCycler 480 unter standardisierten Bedingungen zugeordnet. Die Ergebnisdateien des LightCycler 480 wurden wie in der oben beschriebenen Genexpressionsstudie in die Analysis-Software übertragen. Über den Preference-Reiter des Import-Tools konnten jeder Probe bekannte Merkmale (z.B. Rauchverhalten) zugeordnet werden. Wenn die Analyseergebnisse der LightCycler-480-Software eindeutig waren und jede Probe einen eindeutigen Namen zugewiesen bekommen hatte, ordnete die Multiple-Plate-Analysis-Software alle Proben einer Gruppe automatisch zu. Die Software ermittelte Daten wie Allelfrequenzen und Genotypzahlen und gab diese in einem Tabellenblatt für den gesamten Datensatz aus. Das Tabellenblatt fasste die Phänotyp-, Genotyp- und Haplotypdaten jeder Probe zusammen. Für die Kontingenzanalyse wurde eine einfache Farbcodierung verwendet. Außerdem wurde eine automatische Prüfung auf Einhaltung des Hardy-Weinberg-Gleichgewichts vorgenommen (Daten nicht gezeigt). Die Untersuchungen lassen den Schluss zu, dass bei der Auswahl der Kohorten keine Selektionsfehler aufgetreten waren und dass die Genotypisierung korrekt vorgenommen worden war. Die Software bot zusätzlich zur Tabelle mit den Analyseresultaten auch Möglichkeiten für einen schnellen Export der Daten in stärker spezialisierte Statistikprogramme wie JMP oder SPSS.

Dank der Hilfsmittel zur Qualitätskontrolle lieferte die LightCycler-480-Multiple-Plate-Analysis-Software eindeutige und exakte Geno- und Haplotypisierungsdaten. Es ließ sich beispielsweise direkt folgern, dass die Haplotyp-Verteilung von DRD3 mit dem Rauchverhalten korreliert (s. Abb. 3). Üblicherweise beträgt der Zeitbedarf für solch einen Datensatz inklusive Haplotypisierung mehrere Stunden. Durch Einsatz der LightCycler-480-Multiple-Plate-Analysis-Software ließen sich Analyse und erste grafische Darstellung in weniger als einer Stunde durchführen.

Zusammenfassung

Die zusammenfassende Analyse mehrerer Real-Time-PCR-Studien wurde oft durch die Notwendigkeit für vielfache fehleranfällige und zeitaufwändige Export/Import- oder Copy/Paste-Operationen in Drittanwendungen behindert. Die LightCycler-480-Multiple-Plate-Analysis-Software bietet dagegen auf Ebene der Einzelexperimente und auf der Metadatenebene für umfassende Studien diverse Qualitätskontrollmechanismen und garantiert so eine hohe Ergebnisqualität. Forscher haben einen effizienten und einfach anzuwendenden Werkzeugkasten zur Hand, der Risiken, die zu Datenverlust oder falschen Zuordnungen führen können, vermeidet und einfachen Zugang zu aussagekräftigen Studienergebnissen bietet.

Literatur

1. Katsuno M et al. (2008) Curr Mol Med 8:221–234

2. Schols L et al. (2004) Lancet Neurol 3:291–304

3. Bauer P et al. (2007) BIOCHEMICA 3:10–12

4. Li MD (2006) Curr Psychiatry Rep 8:158–164

* M. Walter und P. Bauer, Abteilung für Medizinische Genetik, Universität Tübingen, 72074 Tübingen

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