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Mikrofluidik ermöglicht schnelle Analyse

Legionellen in Rekordzeit quantifizieren

| Autor/ Redakteur: Hans-Anton Keserue*, Anna-Katharina Ehlert* & Daniel Schaffhauser* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Die Infektionsquelle schnell zu identifizieren, ist bei Ausbrüchen der Legionärskrankheit essenziell, um Maßnahmen zu ergreifen. Durch die Kombination von Mikrofluidik und Durchflusszytometrie können innerhalb von ein bis zwei Stunden präzise Ergebnisse erzielt werden.

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Die Separation der bakteriellen Zielzellen aus einer Probe erfolgt in einer mikrofluidischen Einwegkartusche mittels eines Magnetfelds.
Die Separation der bakteriellen Zielzellen aus einer Probe erfolgt in einer mikrofluidischen Einwegkartusche mittels eines Magnetfelds.
(Bild: rqmicro)

Legionellen-Bakterien wurden erst 1976 entdeckt und beschrieben. Damals fand ein Kongress der Amerikanischen Legion, ein Veteranenverein, statt, während dem zahlreiche Teilnehmer an einer mysteriösen Lungenentzündung erkrankten. Ärzte und Mikrobiologen identifizierten nach fieberhafter Suche ein Bakterium als Auslöser dieser „Legionärskrankheit“ und benannten es Legionella [1].

Im Gegensatz zu anderen Bakterien sind Legionellen vergleichsweise hitzeresistent und vermehren sich bevorzugt bei Temperaturen von 25 °C bis 45 °C. Durch die Etablierung von Warmwassersystemen, Raumklimaanlagen oder auch Whirlpools scheinen sie eine ökologische Nische gefunden zu haben, die sie zu einer ernsten Gesundheitsgefährdung macht. Die Infektion erfolgt über das Einatmen von Aerosolen. Diese entstehen in der Dusche oder in Klimaanlagen, aber auch beispielsweise Zierbrunnen wurden schon als Infektionsquelle identifiziert. Man schätzt, dass in Europa jährlich 10 000 Fälle der lebensbedrohlichen Legionärs­pneumonie auftreten. Die Letalitätsrate beträgt durchschnittlich 10% [2]. Ausbrüche sind besonders gravierend, wenn sie in Krankenhäusern, Altersheimen oder Hotels auftreten. Das Risiko besteht jedoch auch in gewöhnlichen Wohnhäusern. In den letzten Jahren ist in Deutschland eine Reihe von Fällen bekannt geworden, bei denen neuerrichtete Hausinstallationen mikrobiell kontaminiert waren und sich als schwer sanierbar erwiesen [3, 4].

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Jedes Jahr kommt es zu zahlreichen Ausbrüchen, verursacht durch Legionellen, die Klimaanlagen, Kühltürme oder Trinkwassersysteme besiedeln [5]. Der bisher größte Ausbruch von Legionellen in Deutschland ereignete sich 2013 in Warstein. Untersuchungen ergaben, dass eine Kläranlage im Belebtbecken eine hohe Legionellen-Kontamination aufwies und die Keime über einen Fluss zu industriellen Rückkühlanlagen gelangten. Von dort wurden die Legionellen über Aerosole in die Umwelt verteilt und es kam zu 165 Erkrankungen [6]. Problematisch ist, dass die Ausbruchsquelle, wenn überhaupt, oft erst nach rund zwei Wochen identifiziert werden kann, da die Analytik zeitaufwändig und fehleranfällig ist.

Das Standardverfahren hinterfragen

Die etablierte Standardmethode zur Legionellen-Detektion, ISO 11731 [7], basiert auf dem Plattierungsverfahren, das zu sehr variablen Ergebnissen führt und 10 bis 14 Tage dauert [8–10]. Ein ausgedehnter Ringversuch zwischen verschiedenen Laboratorien in den USA hat außerdem gezeigt, dass die Legionellen-Konzentration mit Plattierungsmethoden dramatisch unterschätzt werden kann [11]. Ein Grund dafür ist, dass ein Anteil der in einer Probe vorhanden bakteriellen Zellen zwar lebendig ist, auf dem Agarmedium aber nicht wächst [12] – und damit durch die Standardmethode nicht detektiert wird. Gerade nach Stagnation und chemischer oder thermischer Desinfektion kommen solche Zellen, genannt VBNC-Zellen (englisch für viable but non-culturable) vermehrt vor. Da die Effizienz von Hygienisierungsmaßnahmen mit der Standardmethode überprüft wird, sind die mikrobiologischen Resultate dann natürlich schwer interpretierbar [13, 14]. Es ist deshalb nicht verwunderlich, dass oft schon Wochen nach erfolgten Desinfektionsmaßnahmen wieder sehr hohe Legionellen-Kontaminationen gemessen werden [4, 15].

Bedenklich ist generell, dass die große Mehrheit der Informationen über die Verbreitung und das Verhalten von Krankheitserregern in Wassersystemen mit eben diesen konventionellen, kultivationsabhängigen Verfahren erarbeitet wurden. Dies bedeutet nach neuestem Wissensstand, dass die Genauigkeit und Verlässlichkeit der Daten weder zufriedenstellend, noch ausreichend für die Bewertung der Trinkwasserhygiene ist.

Die neue Methode – schneller und präziser

Die Schnelldetektion der Gesamtzahl an bakteriellen Zellen in einer Wasserprobe mittels Durchflusszytometrie etabliert sich in Wasserlaboren weltweit [16, 17]. Die Firma RQ Micro AG, ein Spin-Off der ETH Zürich, hat sich zum Ziel gesetzt, diese Methode für verschiedene Anwendungszwecke zu optimieren. Dank einer ausgeklügelten Probenaufbereitung, die das interdisziplinäre Team von RQ Micro entwickelt hat, gelingt es Legionellen aus Wasserproben in Rekordzeit zu isolieren, zu detektieren und zu quantifizieren.

Die Methode basiert auf der immunomagnetischen Isolation der Zellen mithilfe magnetischer Partikel und anschließender durchflusszytometrischer Detektion. Von der Probenahme bis zum Resultat vergehen dabei lediglich ein bis zwei Stunden. Im Gegensatz zu den etablierten Verfahren erfasst das Testverfahren von RQ Micro aber sämtliche potenziell infektiösen Legionellen – eben auch jene Zellen, die auf den Agarplatten nicht wachsen (VBNC-Zellen).

Die sprichwörtliche Nadel im Heuhaufen finden

Magnetische Partikel verbinden sich mithilfe eigens entwickelter Antikörper mit der Oberfläche der Legionellen. Durch ein Magnetfeld können sie dann aus der Masse der sich im Wasser befindlichen Begleitflora und Schmutzpartikel „herausgefischt“ werden. Weshalb dieser Schritt nötig ist wird schnell klar, wenn man sich vor Augen führt, dass ein Liter Trinkwasser rund 100 Mio. bakterielle Zellen enthält. Die Detektion von lediglich hundert vorhandenen Legionellen, was einer Konzentration von 0,0001 % entspricht, kommt der sprichwörtlichen Suche nach der Nadel im Heuhaufen gleich. Gleichzeitig zur immunomagnetischen Isolation sorgen die an Antikörper gebundenen, fluoreszenten Farbstoffe dafür, dass die Legionellen über Fluoreszenzemission mit einem Durchflusszytometer erkannt werden können.

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