Massenspektrometrie im mikrobiologischen Labor

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Mikroorganismen sind omnipräsent. Im Alltag stehen sie als wechselseitige Symbionten, harmlose Kommensalen oder krankheitsverursachende Parasiten in direktem Kontakt mit Menschen, Tieren und Pflanzen. Mikroorganismen wie Bakterien und Pilze werden aber auch in der Lebensmittelproduktion, der Umweltbiotechnik, der biopharmazeutischen Produktion und der Produktion von Biopolymeren eingesetzt. Bei diesen biotechnologischen Einsätzen können zusätzlich Mikroorganismen auftreten, die Produktionsabläufe und Produkte durch Kontamination und Toxifikation gefährden. Sie sind daher in allen Bereichen der biotechnologischen Qualitätssicherung von entscheidender Bedeutung. In der (veterinär)medizinischen Forschung und Diagnostik, der biotechnologischen Produktion oder in der Qualitätssicherung müssen die Mikroorganismen schnell und zuverlässig identifiziert und klassifiziert werden.??Bestehende Lösungen??Biochemische Tests wie die „Bunten Reihen“ bilden momentan den Standard in der Mikrobiologie. Sie sind jedoch zeit-, kosten- und arbeitsaufwändig. Darüber hinaus ist eine klare Identifikation unbekannter Spezies in einigen Fällen nur unzureichend möglich. Mit der PCR steht eine sehr schnelle und hochsensitive Identifikationsmethode zur Verfügung, mit der sich auch einzelne Spezies in komplexen Gemischen identifizieren lassen. Nachteilig ist, dass unbekannte Spezies dabei nicht erfasst werden und die Methode bisher sehr umständlich betrieben werden muss. Techniken wie die PCR erfordern zusätzlich ein „Presampling“, eine Vorauswahl, die festlegt, nach welchen Mikroorganismen gezielt gesucht werden soll.??Als Gold-Standard in der taxonomischen Einordnung galt bisher die 16s-rDNA-Sequenzierung. Die Methode erlaubt eine hochpräzise Identifikation und aufgrund von Sequenzüberlappungen auch eine genaue Klassifizierung von unbekannten Mikroorganismen, ist jedoch sehr teuer und arbeitsintensiv. Elisa-Methoden zeichnen sich dadurch aus, dass einzelne Spezies in komplexen Kulturgemischen detektiert werden können. Auch hier sind Arbeits- und Kostenaufwand enorm. Über Methoden wie DNA-Mikroarray-Hybridisierung oder Pulsfeldgelelektrophorese können Mikroorganismen zwar detektiert werden, beide Methoden sind jedoch sehr kostenintensiv und mit hohem Arbeitsaufwand verbunden. Für einige der genannten Methoden wurden Automationslösungen entwickelt, ein High-Throughput-Screening ist mit diesen Systemen aber nach wie vor nur schwer umsetzbar. ??Der Maldi-BioTyper??Als neue Methode steht nun das Maldi-Biotyper-System zur Verfügung, das auf der Maldi-Tof (matrix assisted laser desorption ionisation-time of flight)-Massenspektrometrie-Technologie beruht. Dabei ionisiert ein Laser die in einer auskristallisierten organischen Lösungsmittelmatrix befindlichen Biomoleküle. Die so entstehenden Ionen werden dann in einem elektrischen Feld beschleunigt und durch ein Flugrohr geleitet.??In Abhängigkeit der Masse und Ladung erreichen die geladenen Moleküle den Detektor zu unterschiedlichen Zeiten. Die Detektoreinheit errechnet aus den Flugzeiten die gemessenen Molekularmassen und erzeugt ein Massenspektrum. Mit dem neuen System wird gezielt in einem Massenbereich gemessen, in dem sich Fragmentierungen der stark konservierten 16s-ribosomalen Proteine befinden. Die Technik eignet sich als hochspezifische Fingerprinting-Methode zur Identifikation und Klassifizierung von Mikroorgansimen, aber auch zum Nachweis anderer stabil exprimierter Proteine (Housekeeping Proteins). Der Maldi-Biotyper wird mit einer umfangreichen Referenzdatenbank geliefert, die ständig erweitert wird. Es ist auch möglich, eigene Datenbankeinträge zu generieren. Messdaten von unbekannten Mikroorganismen werden de facto mit den bestehenden Spektren der Referenzdatenbanken verglichen und bis auf die Spezies exakt bestimmt. In vielen Fällen ist sogar eine Bestimmung bis auf die taxonomische Ebene von Subspezies möglich. Die Kultivierungsbedingungen spielen dabei keine große Rolle. Die Software ermöglicht eine vollautomatisch klassifizierende Einordnung der Kandidaten in Dendrogrammen, um deren Verwandtschaftsverhältnisse aufklären zu können. Neu entstandene Subspezies, die aus den in der Datenbank aufgeführten Spezies hervorgegangen sind, kann man ebenfalls leicht einordnen. Die Klassifizierung liefert hohe Übereinstimmungen mit Dendrogrammen, die mit aufwändigen Nukleotidsequenzanalysen erstellt worden sind.??Der Maldi-Biotyper ist einfach zu bedienen und führt zu schnellen und reproduzierbaren Ergebnissen. Nach einer Übernachtkultur genügt das Picken und Auftragen winziger Mengen einer Kolonie aus einer Analysenplatte, um Messungen durchführen zu können. Das Zellmaterial, kann nach dem Auftragen unmittelbar zur Messung eingesetzt werden. Empfohlen wird eine sehr schnelle Präparation der Mikroorganismen. Eine für den Nachweis entwickelte und standardisierte Präparationsmethode, bei der die Zellen kurz aufgeschlossen und die Analyten pelletiert werden, gewährleistet präzisere Spektren, verlängert die Probenvorbereitung aber nur unwesentlich. Bei dieser Präparationsmethode werden zusätzlich potenziell virulente Keime inaktiviert.??Die Messung im Maldi-Tof-MS-Gerät gestaltet sich einfach und komfortabel. Die Analysenplatte wird in einen Schacht eingelegt und die Messung über eine entsprechende Software gesteuert. Rein mikrobiologisch interessierte Anwender können automatische Routine-Messungen durchführen, die in Peaklisten resultieren und mit den Referenz-Peaklisten der Datenbanken verglichen werden. Die Software bietet alle MS-typischen Funktionalitäten um Rohspektren zu prozessieren, wobei die Peaklisten der kommerziellen Biotyper-Referenzdatenbank ebenfalls mit Rohspektren hinterlegt sind. ??In der Praxis kann man eine Probe vom Abnehmen der Übernachtkultur über das Auftragen auf die Probenplatte, die automatische Analyse und Software-Auswertung in fünf Minuten bearbeiten und den Mikroorganismus identifizieren. Für Hochdurchsatzanalysen können 100 Proben in etwa 1,5 Stunden abgearbeitet werden. Die Geräte eignen sich auch für nicht-mikrobiologische Fragestellungen, beispielsweise aus dem Bereich der klinischen Proteomik.??Krankheitsüberwachung??Infektionskrankheiten, die durch Mikroorganismen verursacht werden, stellen eine immer größer werdende gesundheitliche Bedrohung für den Menschen dar und sind mit erheblichen Kosten im Gesundheitssystem verbunden. Die Mikroorganismen stehen im Fokus der human- und veterinärmedizinischen Diagnostik und Forschung. Durch den evolutiven Wettlauf, bei dem unablässig neue virulente mikrobiologische Varianten entstehen, gewinnen diese zunehmend an Bedeutung. Deren Identifikation ist daher eine unablässige Voraussetzung für die diagnostische Forschung und klinische Überwachung von Krankheitserregern. Ebenso bedeutend ist der Einsatz zuverlässiger Identifikationsmethoden in der Veterinärmedizin, zumal der Übergang von der Tiergesundheit über Tiere als Vektoren für Humanpathogene bis zur Lebensmittelkontrolle fließend ist.??Verwaltung und Kontrolle??Bei biotechnologisch basierten Produktionsverfahren wie der Nahrungsmittel- und biopharmazeutischen Produktion sowie zahlreichen weiteren biotechnologischen Anwendungen ist die Mikroorganismen-Überwachung entscheidend. Es gilt dabei, Mikroorganismen in jedem dieser Bereiche schnell und zuverlässig zu identifizieren. In der Lebensmittelindustrie werden ausgewählte Mikroorganismen zur Herstellung von z.B. Jogurt, Käse oder Bier verwendet. Die eingesetzten Stämme müssen regelmäßig überprüft und kontrolliert werden, sodass reine Stammsammlungen erhalten werden. Eine derartige Verwaltung von Mikroorgansimen spielt auch in der weißen Biotechnologie eine Rolle, wo Mikroorganismen gezielt in Umweltfragen eingesetzt werden, wie in der Petromikrobiologie beim Abbau von Ölen zur Sanierung von Altlasten. In vielen Ländern existieren Stammsammlungen von lebenden Mikroorganismen, in denen diese archiviert und aufbewahrt werden. Der ?Maldi-Biotyper eignet sich zur Überwachung und Validierung dieser Stammsammlungen.??Qualitätssicherung ??Wo immer nützliche Mikroorganismen zu Produktionszwecken verwendet werden, treten auch Vertreter auf, die die erzeugten Produkte verderben, kontaminieren und durch Toxine vergiften können. Für die Qualitätssicherung von Produkten oder zur mikrobiellen Überwachung von Produktionsprozessen sind verlässliche und schnelle Analyseverfahren essenziell. Ein zu spätes Stoppen von Produktionsläufen und Verwerfen der Fermenterinhalte aufgrund nicht erkannter Kontaminationen in der biopharmazeutischen Produktion kann Kosten in Millionenhöhe verursachen. Auch hier müssen Mikroorganismen schnell und zuverlässig identifiziert werden. ??Fazit??Da Mikroorganismen-Gruppen für unterschiedliche Fachdisziplinen relevant sind, ist es über den humanmedizinischen Diagnostik- und Forschungsbereich hinausgehend wünschenswert, spartenübergreifende All-in-one-Analysensysteme zur Verfügung zu haben. Anwendungen in der Veterinärmedizin münden beispielsweise direkt in der Sicherung von tierischen und allen anderen durch mikrobielle Kontaminationen gefährdeten Produktgruppen. Egal ob sie natürlich oder auf biotechnologischem Wege erzeugt wurden. Dasselbe gilt in der Qualitätssicherung biopharmazeutischer und kosmetischer Produkte oder im Umweltbereich. Bei der Kontrolle von Stammsammlungen, produktionsbezogenen Sammlungen oder in der mikrobiologischen Grundlagenforschung und Systematik müssen Mikroorganismen zudem auch verwaltet werden. Für den Einsatz im Labor stehen viele verschiedene Methoden zur Auswahl, die oft nicht zielführend sind und einen hohen Arbeits-, Zeit- und Kostenaufwand erfordern.??Der Maldi-Biotyper zeigt dagegen leistungsstarke Time-to-Result-Werte, selbst wenn vor der Analyse keine eingrenzenden Vorkenntnisse bestehen. Nonfermenter können mit einer höheren Auflösung identifiziert werden als mit biochemischen Methoden. Sogar Mischkulturen lassen sich nach Bildung von Einzelkolonien hinreichend untersuchen. Kolonien, die auf der Kulturschale morphologisch nicht unterscheidbar sind, erweisen sich bei einer näheren Biotyper-Analyse oft als distinkte Spezies. Das Maldi-Biotyper-System stellt eine zuverlässige Technologie dar, die schnell und einfach zu bedienen ist. Die Kosten pro Analyse sind niedrig, sodass sich das System rasch amortisiert.

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