PROTEOMICS Massenspektrometrische Revolution der Proteinanalytik

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Das Proteom, das als die Gesamtheit aller vom Genom einer Zelle oder ?eines Organismus exprimierten Proteine definiert ist, rückt mehr und mehr in den Fokus zahlreicher internationaler Forschungsgruppen und pharmazeutischer Firmen. Da das Genom und die ?daraus transkribierte RNA den momentanen Zustand einer lebenden Zelle/Organismus nicht ausreichend beschreiben kann, haben Wissenschaftler die Notwendigkeit erkannt, die aktuell vorhandenen Proteine zu charakterisieren.?Daraus entstand in den frühen 90er Jahren eine neue wissenschaftliche Disziplin namens Proteomics, die es sich zum Ziel gemacht hat, Proteinmuster einer Zelle, eines Gewebes oder eines Organismus qualitativ und quantitativ zu bestimmen. Ein derartig zeitabhängiges Proteinprofil ?würde neue Erkenntnisse für die zellularen Mechanismen im Hinblick auf Krankheitsbilder, Arzneistoffentwicklung, Zellalterung und Umwelteinflüsse geben können.?Es ist leicht einsichtig, dass diese herausfordernden Fragestellungen nicht durch nur eine einzige analytische Technik zu lösen sind. Aufgrund der enorm hohen Anzahl der zu bestimmenden Proteine, ihrer über post-translationale Modifikationen entstandenen Isoformen und des notwendigen dynamischen Bereiches von bis zu 1010 ist vielmehr eine intelligente Verbindung von Trenn- und Detektionstechniken mit Bioinformatiksoftware notwendig. Des weiteren baut Proteomics auf den Erkenntnissen aus der Genom-Forschung auf und wäre ohne diese nicht denkbar.??

Neue MS-Entwicklungen?revolutionieren Protein-Chemie?Die Entwicklung von MALDI (Matrix-assisted laser desorption ionization) und ESI (Electrospray Ionisation) als Ionisierungstechniken hat zum ersten Mal in den 80er Jahren Proteine und Peptide massenspektrometrisch direkt bestimmbar gemacht und wurde 2002 mit dem Chemie-Nobelpreis für Tanaka (Laser desorption) und Fenn (Electrospray) gewürdigt (siehe InfoClick-Kasten am Ende des Artikels). In der Kombination von Maldi mit TOF-Massenanalysatoren und ESI mit IonTrap- oder Q-Tof-Massenanalysatoren erlauben moderne Massenspektrometer die schnelle und empfindliche Charakterisierung von Proteinen in mitunter komplexen Mischungen, wie sie nach Extraktion aus Zellen oder -kompartmenten auftreten. Generell ist Maldi eine Offline-Technik und kann nicht direkt mit Trenntechniken wie Flüssigkeitschromatographie (LC) oder Kapillaraelektrophorese (CE) kombiniert werden. Neueste Entwicklungen über den Umweg der Fraktionssammlung oder direktes Spotting auf Target-Plates werden dies aber in naher Zukunft im Routinebetrieb ermöglichen (Abb. 1). ESI kann direkt mit LC oder CE online gekoppelt werden und erlaubt somit die direkte Analyse komplexer Peptidgemische.?Nach wie vor besteht aber die Problematik der Auftrennung der zu Anfang komplexen Proteingemische, da selbst neueste MS/MS-Massenspektrometer über eine MS/MS-Peptiddatenerzeugungsrate über 1 Hertz kaum hinauskommen. Die wichtigsten Trenntechniken sind die Gel-elektrophorese (ein oder zweidimensional) und die LC (ein- oder mehrdimensional). Je nach Fragestellung, Komplexität der Probe und eingesetzer Ionisierungstechnik sind Kombinationen von Gelelektrophorese mit LC realisiert. Ein häufig verwendeter Arbeitsablauf beginnt mit der 2D-Gelelektrophorese mit anschließender Maldi-MS oder MS/MS, weiterhin kommen die Kombinationen 2D-Gel mit anschließender LC/MS/MS, 1D-Gel mit LC/MS/MS oder 2D-LC/MS/MS oder auch ausschließlich LC-basierende Trennungen (gelfreie Proteomics) zum Einsatz. Besonders die gelfreien Techniken sind von großem Interesse, da speziell die 2D-Gelelektrophorese zeitaufwändig ist und äußerst exaktes Arbeiten erfordert. Diese laufen unter dem Namen shot-gun Proteomics (oder 2D-LC/MS/MS, Ionentauscherchromatographie direkt gekoppelt mit Umkehrphasenchromatographie) mit der Variante eines Zwischenschrittes der Fraktionssammlung nach der ersten Dimension zur Verbesserung der Sequenzabdeckung. Alternative Ansätze laufen über chemische Derivatisierung (Tagging) und diagonale Chromatographie wie COFRADIC (combined fractional diagonal chromatography; siehe weiterführenden Artikel im InfoClick-Kasten) oder ICAT (isotope coded affinity tag), das ein quantitatives Proteinprofil über Isotopenlabeling, gefolgt von Affinitätschromatographie und 2D-LC/MS/MS erzeugen kann.?Computer-Algorithmen waren?Grundlage der MS-Revolution?Grundlegend für die massenspektrometrische Revolution der Protein-Analytik war die Entwicklung von Computer-Algorithmen, die die massenspektrometrische Information von Einzelpeptiden oder Peptidgemischen, die nach enzymatischem Verdau des zu suchenden Proteins entstanden sind, mit Proteinen aus Datenbanken korrelieren und so das Protein ohne de-novo-Sequenzierung identifizieren. Für die massenspektrometrische Analyse selbst werden zwei Wege beschritten, die als PMF (Peptide mass fingerprinting, peptide mass mapping) und MS/MS Search bezeichnet werden. PMF setzt wegen eines fehlenden Trennungsschrittes - die Peptidfragmente werden zusammen massenspektrometrisch erfasst - eine gereinigte Proteinprobe voraus. Diese Methode wird daher i.d.R. mit 2D-Gelelektrophorese kombiniert und aufgrund der erforderlichen Massengenauigkeit nahezu ausschließlich mit Maldi-Tof durchgeführt. Es werden die experimentell bestimmten Peptid-Molekulargewichte mit den Datenbankeinträgen verglichen, um das Protein zu identifizieren. Eine quantitative Information oder die Bestimung und Lokalisierung post-translationaler Modifikationen ist über die MS-Information zwar nicht möglich, doch enthält die vorhergeschaltete Gelelektrophorese einen nicht zu unterschätzenden Informationsgehalt bezüglich Quantität und physiko-chemische Eigenschaften (MW, pI).?Beim MS/MS Search wird neben dem Molekulargewicht auch die Sequenzinformation, wie sie durch CID (collision-induced dissociation)-Experimente erhalten wird, für die Protein-Identifizierung über Datenbanksuche herangezogen. Dieses im Vergleich zur einfachen Molekulargewichtsbestimmung Mehr an Information führt zu größerer Sicherheit in der Proteinidentifizierung, ermöglicht zudem auch eine genaue Lokalisierung von post-translationalen Modifikationen und hat zu einer wahren Explosion in der Entwicklung von Hybrid-Massenspektrometern mit MS/MS-Möglichkeit sowohl für ESI- als auch für Maldikopplung geführt.?Aufgrund der komplexen biologischen Fragestellungen haben sich innerhalb der Proteomics mehrere Forschungsrichtungen etabliert. Bei Protein-Expressions-Studien wird in erster Linie das Ziel verfolgt, qualitativ und evtl. quantitativ Proteine unterschiedlicher Herkunft/Proben zu bestimmen, während in der Protein-Charakterisierung vor allem eine genaue Aufklärung der Proteinstruktur inklusive post-translationaler Modifikationen im Fokus steht. Aus der Erkenntnis, dass Proteine innerhalb eines lebenden Organismus niemals für sich arbeiten, sondern immer in Verbindung mit anderen Proteinen oder Protein-Komplexen, leitete sich die Forschungsrichtung der Protein-Protein-Interaktion ab.?So konzentriert sich momentan der größte Anteil an Proteomics-Wissenschaftlern auf die Frage der Protein-Expression innerhalb eines Systems (Organismus, Gewebe, Zelle, Zellenuntereinheit) zu einem bestimmten Zeitpunkt. Hierbei ist sowohl eine qualitative als auch eine quantitative Aussage hinsichtlich der Proteine erwünscht. Daten dieser Studien zielen auf die Erforschung von Proteinen oder Proteinmustern als Krankheitsmarker, den Einfluss von Pharmaka auf das ?Expressionsmuster oder die Proteinprofile genmanipulierter Spezies. Für die quantitative Aussage werden neben der Information aus der Gelelektrophorese oder auch Lab-on-a-Chip-Technik zunehmend alternative Techniken wie „stable isotope dilution“ eingesetzt. Diese Technik macht sich zu Nutze, dass Peptidpaare chemisch gleicher Zusammensetzung, aber unterschiedlicher Isotopenverhältnisse, im Massenspektrometer differenziert werden können und so eine relative Quantifizierung von Probenpaaren erhalten wird. Die Einführung leichter und schwerer Isotope in jeweils zu vergleichende Probenpaare kann während der Proteinexpression aus Bakterienkulturen (Einbau durch isotopenmarkierte Aminosäuren), im Zelllysat (chemische Derivatisierung einer Aminosäure, Tagging) oder während des Verdau-Prozesses (Verdau in Sauerstoff-18-Wasser) eingeführt werden.?Gerade in Körperflüssigkeiten wird die Problematik des hohen Verteilungsgrades der Proteine sichtbar. So müssen i.d.R. die hochexprimierten Proteine wie Globuline oder Albumin erst abgereichert werden, um das Proteinprofil der potenziell interessanten Proteine zu erfassen (Abb. 2).?Besondere Anforderungen ?an die Bioinformatik? Um statistisch relevante Aussagen treffen zu können, müssen in der Regel große Probenkollektive analysiert werden, was besondere Anforderung an die Bioinformatik stellt. Neue Software-Lösungen wie SpectrumMill erlauben eine schnelle Korrelation und Vergleich unterschiedlicher Probensets (Abb. 3). Weiterhin werden zunehmend statistische Methoden (Principal Component Analysis, Pattern Recognition) eingesetzt, um gezielt Unterschiede im Proteinprofil sichtbar zu machen.?Die beiden neben der Protein-Expression weiteren Forschungsbereiche innerhalb der Proteomics beschäftigen sich mit der genauen Charakterisierung von Proteinen und der Funktionsweise von Proteinen und Proteinkomplexen.?Im Gegensatz zu DNA und RNA bestehen Proteine in einem Organismus normalerweise nicht nur aus der zugrunde liegenden Aminosäuresequenz, sondern einzelne Aminossäuren sind häufig post-translational modifiziert. Hierbei sind in erster Linie Acetylierung, Phosphorylierung oder Glykosylierung zu nennen. Oftmals erhalten die Proteine erst durch diese Modifikationen ihre Funktionalität bzw. Bestimmung innerhalb der Zelle und sind daher essentiell für ein Verständnis der Vorgänge auf zellularer Ebene. Die genaue Charakterisierung erfordert einen ungleich höheren analytischen Aufwand als die reine Protein-Identifizierung, da eine nahezu 100-prozentige Sequenzabdeckung erreicht werden muss. So wird die Probenvorbereitung inklusive Anreicherung des Zielproteins wichtiger und oftmals sind komplementäre Ansätze (spezielle Gele/Anfärbung, verschiedene Enzyme zum Verdau, spezielle MSn-Scans) vonnöten, um das Ziel zu erreichen. ?Protein-Protein-Interaktionsstudien bauen auf der Erkenntnis auf, dass nahezu kein Protein alleine seine Funktion ausführen kann, sondern im Zusammenspiel mit anderen Proteinen wirkt. Ein Ansatz, um diese Komplexe und damit Protein-Netzwerke aufzuklären, liegt in der Yeast-2-Hybrid-Methodik, bei der oft in eukaryontischen Systemen mittels genetischer Assays gearbeitet wird. Zur Identifizierung der beteiligten Proteine werden ebenfalls massenspektrometrische Methoden eingesetzt.?Von instrumenteller Seite ist das?Potenzial noch nicht ausgeschöpft?In den letzten zehn Jahren wurde auf dem Gebiet der Systembiologie unter anderem durch die Weiterentwicklungen in der Massenspektrometrie und Bioinformatik gewaltige Fortschritte erzielt. Neue biologische Fragestellungen konnten durch diese technischen Errungenschaften erst angegangen werden. Durch eine gemeinsame Anstrengung interdisziplinärer Forscherteams aus Biologen, analytischen Chemikern und Informatikern wurden leistungsstarke Methoden zur Erforschung des Proteoms entwickelt. Von instrumenteller Seite ist sicherlich das Potenzial im Hinblick auf integrierte Systeme und Anpassung/Optimierung von Arbeitsabläufen noch nicht voll ausgeschöpft. ?Trotzdem ist aufgrund der komplexen Zusammenhänge in lebenden Organismen noch viel im Bereich der Grundlagenforschung zu tun. Bis heute kann das Gesamtproteom zu einem definierten Zeitpunkt nicht bestimmt werden, auch nicht durch Verwendung komplementärer Ansätze in MS-basierter Proteomics. Das hat einmal mit dem hohen, abzudeckenden dynamischen Bereich der Proteine zu tun. Andererseits wird durch die Dynamik des Gesamtsystems als solches jede Analyse nur eine Momentaufnahme darstellen können und überdies sind große heterogene Datenmengen hierfür notwendig.?Proteomics-Forschung hat zweifelsohne ein großes Potenzial im Bereich der Biomarker-Forschung, wodurch Proteinprofilbestimmung Krankheiten früh diagnostiziert werden können. Weiterhin kann auch das Ansprechen medikamentöser Behandlung auf eine Krankheit beobachtet werden. Große Fortschritte werden durch Systembiologie-Forschung im Verstehen der Funktionsweise von Zellen/Organismen erreicht, was u.a. die gezielte Entwicklung neuer Pharmaka unterstützt.

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