Maßgeschneiderte tomographische Einblicke ins Zellinnere

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Max Planck-Institut für Biochemie

Das Problem: Die meisten Zellen sind zu „dick“

Elektronen haben durch ihre negative Ladung im Vergleich zu den elektrisch ungeladenen Photonen eine sehr hohe Wechselwirkung mit Materie, deshalb lassen sich im Unterschied zur Lichtmikroskopie nur wesentlich dünnere Proben durchstrahlen. Bei einer typischen Beschleunigungsspannung eines Transmissionselektronen-Mikroskops (TEM) von 300 000 V (300 kV) stößt ein Elektron im Mittel nach ca. 300 nm mit einem Atom der vitrifizierten Probe zusammen und wird dadurch von seinem Weg abgelenkt. Bei dickeren Proben ähnelt das Resultat der Betrachtung eines Bildes durch eine getrübte bzw. bei beträchtlichen Dicken einer geschwärzten Glasscheibe. Bereits bei der 3-fachen Dicke (ca. 900 nm) gelangen nur noch 5% der Elektronen ungestreut – also nutzbar – durch das Objekt. Folglich können nur Proben analysiert werden, die dünner als 500 nm sind. Kleine Bakterien können somit direkt untersucht werden, jedoch sind die meisten eukaryontischen Zellen (z.B. humane/tierische Zellen, Hefen) höchstens in den Randbereichen dünn, d.h. transparent genug für eine direkte elektronentomographische Untersuchung. Damit sind 80 bis 90% des Zellvolumens ohne Präparation zumeist nicht zugänglich, so auch der einige Mikrometer (µm) „dicke“ Zellkern. Deshalb ist es notwendig, den zu untersuchenden Bereich möglichst dünn aus diesen Zellen heraus zu präparieren und so bisher unzugängliche Bereiche quasi freizulegen.

Bisher wurden größere Proben (< 0,3 mm) mit einem auf -196 °C gekühlten Diamantmesser mechanisch in sehr dünne Schichten (50 bis 200 nm) geschnitten – die Kryo-Ultramikrotomie [2, 3]. Neben der geringen Erfolgsrate bei dieser handwerklich sehr anspruchsvollen Methode treten auch gravierende Artefakte [4, 5] auf, beispielsweise eine unregelmäßige Kompression von 30 bis 50% in Schnittrichtung und Unebenheiten. Ein weiterer Nachteil ist auch das „blinde“ Schneiden – einzelne Zellen können nicht gezielt präpariert werden, sondern nur solche, die zufällig in der geschnittenen Schicht liegen. Daher war es notwendig, einen neuen Ansatz zu wählen.

Die Lösung: Neue Einblicke per Ionenstrahl-Mikroskop

In der Halbleitertechnologie hat sich in den letzten Jahrzenten eine Methode etabliert, die zur Fehleranalyse und zur Präparation dünner Lamellen von Computer-Chips für die Transmissions-Elektronen-Mikroskopie entwickelt wurde – das Ionenstrahl-Mikroskop (FIB: Focused Ion Beam) [6].

Die Kombination eines fokussierten Ionenstrahls mit einem Raster-Elektronen-Mikroskop (REM) in einem Instrument ermöglicht die zerstörungsfreie Betrachtung der Probe mit hoher Auflösung im Elektronenstrahl und gleichzeitig eine gezielte Abtragung im Nanometerbereich mit dem Ionenstrahl (s. Abb. 1). Dabei rastert der fokussierte Ionenstrahl mit einem Durchmesser von 15 bis 35 nm einen zuvor definierten Bereich Punkt für Punkt ab und die mit 30 000 V (30 kV) beschleunigten schweren Gallium-Ionen schlagen Moleküle bzw. Atome aus der Oberfläche heraus. Der Effekt gleicht für jeden bestrahlten Punkt einem winzigen Meteoriteneinschlag auf der Probenoberfläche. Damit lässt sich nun gezielt Punkt für Punkt, Linie für Linie und schließlich Schicht für Schicht Material aus der Probe entfernen, bis letztendlich eine dünne elektronentransparente Lamelle übrig bleibt. Dieser Prozess lässt sich zu jedem Zeitpunkt im REM beobachten und gegebenenfalls anpassen oder korrigieren.

Mit dieser Methode werden eine mechanische Interaktion sowie konsekutive Artefakte, wie die genannte Kompression und Unebenheit, vermieden. Bisher wurde der fokussierte Ionenstrahl nur an relativ widerstandsfähigen Materialien wie Metallen und Halbleitern (z.B. Silizium) erprobt, aber nicht bei sensiblen und „weichen“ Proben wie biologischen Zellen, zudem sind die FIB-Mikroskope für Raumtemperatur oder hohe Temperaturen ausgelegt, nicht aber für die niedrigen Temperaturen für Kryo-Anwendungen. Da die vitrifizierten Zellen zu keinem Zeitpunkt wärmer als -140 °C werden dürfen, müssen auch alle Transfers – in das Mikroskop und wieder heraus – diese Temperatur garantieren. Zudem würde sich bei Kontakt der eiskalten Probe mit der Umgebungsluft sofort die Luftfeuchtigkeit als dicke Schicht kristallinen Eises auf der Oberfläche niederschlagen und sie damit unbrauchbar machen.

Für die gezielte Präparation von schockgefrorenen Proben mit dem Ionenstrahl waren instrumentelle Weiterentwicklungen notwendig, wie ein Probentisch, der die Probe im Vakuum des Mikroskops auf unter -140 °C kühlt und der es erlaubt, die Probe aus beliebigen Richtungen für eine Lamellenpräparation zu erreichen. Zur Vermeidung von Kontamination beim Transfer der Probe wird diese in einer speziell entwickelten Einbaustation unter flüssigem Stickstoff in ein „Shuttle“ transferiert, welches anschließend über eine Vakuumschleuse in das Mikroskop gebracht wird.

Diese Neuentwicklungen [7, 8, 9] machen nun die in den Materialwissenschaften etablierte FIB-Technologie erstmals für vitrifizierte biologische Proben zugänglich und eröffnen die Möglichkeit, gezielt maßgeschneiderte „Fenster“ in ausgewählte Zellbereiche zu schneiden (s. Abb. 2). In Kombination mit der Kryo-Elektronentomographie lassen sich nun Bereiche und Vorgänge im Inneren der Zelle mit unerreicht hoher Auflösung abbilden und in der dreidimensionalen Rekonstruktion im zellulären Kontext interpretieren.

Abbildung 3 zeigt einen Ausschnitt aus einem zentralen Bereich innerhalb einer Zelle: Zu erkennen ist ein Teil des Zellkerns (grau), der die Erbinformation enthält – mit seinen Kernporen (blau), die den selektiven Transport von RNA und Proteinen ermöglichen – Mitochondrien (braun), die „Kraftwerke der Zelle“ – Ribosomen (gold), an denen die Proteinbiosynthese stattfindet – Mikrotubuli (orangefarbene Röhrchen), Proteinfilamente, die als Teil des Cytoskeletts der Zelle Stabilität verleihen und an Transportvorgängen innerhalb der Zelle beteiligt sind und das endoplasmatische Retikulum (orange), das unter anderem die Aufgabe besitzt, Proteine und Lipide zu modifizieren. Das neue Verfahren der Kryo-FIB-Präparation [8] eröffnet Einblicke in Zellbereiche, die bisher nahezu unzugänglich waren und bietet auf diese Weise völlig neue Möglichkeiten in der Erforschung medizinischer und zellbiologischer Fragestellungen.

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