Maßgeschneiderte tomographische Einblicke ins Zellinnere

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Max Planck-Institut für Biochemie

Potenzial der Technik in Medizin und Biologie

Mithilfe der Kryo-FIB-Präparation ist es nun möglich, komplexe zellbiologische Vorgänge und makromolekulare Strukturen an jedem beliebigen Ort der Zelle in einem „dreidimensionalen Schnappschuss“ darzustellen und zu untersuchen. Ein Beispiel für die Untersuchung solcher Strukturen ist die detaillierte Analyse des Kernporenkomplexes, der selektiv den Transport von Molekülen zwischen Zellkern und dem Zytoplasma regelt. Bisher war es lediglich möglich, isolierte Zellkerne im Transmissionselektronenmikroskop zu untersuchen. Mithilfe der Kryo-FIB-Methode können nun Zellkerne und Kernporenkomplexe in situ, an ihrem Ursprungsort in der Zelle präpariert und untersucht werden. Das Potenzial der neuen Präparationstechnik lässt sich daran sehr gut verdeutlichen: Bildbearbeitungstechniken, die auf der Mittelung von Daten beruhen (subtomogram averaging) und die aus vielen einzelnen schlecht aufgelösten Strukturen eine höher aufgelöste Struktur liefern, sind dabei eine wesentliche Voraussetzung. Im Fall von „ungeschnittenen“ Proben waren noch mehr als 400 Kernporen notwendig, um eine Auflösung von 6 nm zu erreichen [10]. Mit dem Einsatz der hier beschriebenen FIB-Technologie konnte durch die Mittelung von lediglich zehn Kernporenkomplexen eine Auflösung von 7,9 nm erzielt werden [8].

Auch für die medizinische Forschung ist dieser neue Ansatz interessant, da sich hiermit pathologische Strukturen in Zellen und Geweben, wie amyloide Plaques in ihrem nativen Zustand untersuchen lassen. Solche fehlgefalteten Proteinaggregate sind charakteristische Merkmale bei neurodegenerativen Erkrankungen, z.B. Alzheimer, und stehen im Verdacht unter anderem für das Absterben von Nervenzellen verantwortlich zu sein. Allerdings ist noch unklar, ob und wie diese Aggregate zum Absterben der betroffenen Nervenzellen führen oder ob diese Veränderungen vielleicht nicht die Ursache, sondern nur ein Begleiteffekt sind. Solche Strukturen in erkrankten Nervenzellen könnten mithilfe der Kryo-FIB-Präparation gezielt freigelegt und mit der Kryo-Elektronen-Tomographie hochaufgelöst dargestellt werden. Jedoch sind auch für diese herausfordernden Untersuchungen weitere methodische Entwicklungen notwendig, beispielsweise die Verbesserung von Einfrier- und Präparationsmethoden für Gewebe, die Entwicklung korrelativer lichtoptischer Methoden und darüber hinaus die Verbesserung der Auflösung in der Kryo-ET, damit auch kleinere Proteinkomplexe im Tomogramm sichtbar gemacht werden können.

Literatur

[1] Baumeister W. From proteomic inventory to architecture. FEBS Letters 2005; 579(4):933-7

[2] McDowall AW, Chang JJ, Freeman R, Lepault J, Walter CA, Dubochet J. Electron microscopy of frozen hydrated sections of vitreous ice and vitrified biological samples. Journal of Microscopy 1983(Pt 1):1-9

[3] Al-Amoudi A, Diez DC, Betts MJ, & Frangakis AS. The molecular architecture of cadherins in native epidermal desmosomes. Nature 2007; 450(7171):832-838.

[4] Al-Amoudi A, Studer D, Dubochet J. Cutting artefacts and cutting process in vitreous sections for cryo-electron microscopy. Journal of Structural Biology 2005; 150(1):109-21

[5] Hsieh CE, Leith A, Manella CA, Frank J, Marko M. Towards high-resolution three-dimensional imaging of native mammalian tissue: electron tomography of frozen-hydrated rat liver sections. Journal of Structural Biology 2006; 153(1):1-13

[6] Giannuzi LA (Hrsg): Introduction to Focused Ion Beams: Instrumentation, Theory, Techniques and Practice. Springer, Berlin 2005

[7] Marko M, Hsieh C, Schalek R, Frank J, & Mannella C. Focused-ion-beam thinning of frozen-hydrated biological specimens for cryo-electron microscopy. Nature Methods 2007; 4(3):215-217.

[8] Rigort A & Bäuerlein FJB, Villa E, Eibauer M, Laugks T, Baumeister W & Plitzko JM. Focused ion beam micromachining of eukaryotic cells for cryoelectron tomography. Proceedings of the National Academy of Science USA 2012; 109(12):4449-54.

[9] Rigort A, Bäuerlein FJB, Leis A, Gruska M, Hoffmann C, Laugks T, Böhm U, Eibauer M, Gnaegi H, Baumeister W & Plitzko JM. Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography. Journal of Structural Biology 2010; 172(2):169-79

[10] Beck M, Lucic V, Förster F, Baumeister W, Medalia O. Snapshots of nuclear core complexes in action captured by cryo-electron tomography. Nature 2007; 449:611-15

* F.J.B. Bäuerlein, T. Laugks, E. Villa, M. Eibauer, A. Rigort, J.M. Plitzko: Max-Planck-Institut für Biochemie, Abteilung für molekulare Strukturbiologie, 82152 Martinsried, Tel. +49 (0) 89 / 85 78 - 26 28

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