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3D-Zellkultur Mesenchymales Gewebe aus Stammzellen und etablierten Zelllinien

Autor / Redakteur: Björn Steinhoff* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Eine neue Technologie erlaubt es, mesenchymale Stammzellen in der 3D-Zellkultur erfolgreicher und effizienter zu züchten und in verschiedene Gewebearten auszudifferenzieren. Die Technik ist einfach in der Handhabung und kompatibel mit einer Reihe von Downstream-Applikationen.

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Abb. 1: Einlagerung von Collagen durch MSCs von Ratten, die sich in einer 3D-Zellkultur unter Verwendung von Alvetex-Scaffold zu Knochenzellen ausdifferenziert haben. Massons Trichrom-Färbung einer extrazellulären Collagenmatrix. Beachten Sie die Einlagerung bedeutender Mengen von Collagen in den oberen Schichten des Gerüstes. Maßstabsleiste: 40 μm
Abb. 1: Einlagerung von Collagen durch MSCs von Ratten, die sich in einer 3D-Zellkultur unter Verwendung von Alvetex-Scaffold zu Knochenzellen ausdifferenziert haben. Massons Trichrom-Färbung einer extrazellulären Collagenmatrix. Beachten Sie die Einlagerung bedeutender Mengen von Collagen in den oberen Schichten des Gerüstes. Maßstabsleiste: 40 μm
(Bild: Fisher Scientific)

Basierend auf einer zunehmenden Evidenzlage wird allgemein anerkannt, dass das Kultivieren von Zellen in dreidimensionalen (3D) Mustern zu einer besseren Viabilität, Differenzierung und Funktion im Vergleich zu vorhandenen konventionellen Kulturensystemen führen kann, bei denen die Zellen ausgebreitet als Einzelschicht auf zweidimensionalen (2D) Substraten wachsen. Diese verbesserten Eigenschaften sind sowohl für den Erhalt in-vivo-ähnlicher Phänotypen als auch für das Potenzial zur Zelldifferenzierung und die spätere Funktionalität von Bedeutung, wie sie für nachfolgende Anwendungen erforderlich sind.

Alvatex Scaffold ist ein neues Substrat, das einfache und routinemäßige 3D-Kulturen ermöglicht. Es besteht aus einem hochporösen Polystyrengerüst, das als 200 µm dicke Membran konstruiert wurde, um den Zugang für Zellen und einen effektiven Austausch von Gasen und gelösten Substanzen zu ermöglichen. Die Zellen dringen in das Gefüge des Gerüsts ein, behalten ihre natürliche 3D-Struktur bei und stellen enge 3D-Wechselbeziehungen mit benachbarten Zellen her. Anders als bei konventionellen 2D-Kulturen wachsen die Zellen in Alvatex Scaffold nicht als Einzelschicht und unterliegen nicht dem Übergang in flache Formen, der zu abnormen Veränderungen der Gen- und Proteinausprägung und infolgedessen der Zellfunktion führen kann.

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Mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind anhaftende multipotente Zellen, die aus Gewebe wie Knochenmark stammen und die Fähigkeit besitzen, in vitro zu einer Reihe von Gewebearten auszudifferenzieren, darunter Knochen, Knorpel und Muskeln [1]. Nachfolgend soll gezeigt werden, dass aus dem Knochenmark erwachsener Ratten gewonnene MCSs erfolgreich in 3D in Alvatex Scaffold kultiviert und dazu angeregt werden können, effektiver als ihre Pendants in 2D in osteogene und adipogene Derivate auszudifferenzieren. Außerdem wird die Knochenbildung sowie die Produktion von extrazellulärer Matrix durch MG 63-Zellen, die eine etablierte, von einem menschlichen Osteosarkom stammende Zelllinie darstellen, erläutert. Die Technologie ist einfach zu verwenden und kompatibel zu einer Reihe standardmäßiger nachfolgender Analysetechniken..

3D-Kultur von MSCs

In Alvetex Scaffold gezüchtete Populationen primärer MSCs von Ratten zeigten über den 14-tägigen Versuchszeitraum ein konsistentes und zunehmendes Wachstumsmuster. Die Viabilität der Zellen wurde durch einen MTT-Test bewertet. Die Werte für das Absorptionsvermögen nahmen linear zu und bildeten während dieses Zeitraums keine Plateauphase, was weiteres Wachstumspotenzial nahelegt. Durch Einfärben der 3D-Kultur mit Neutralrot wurden die Gesamtverteilung und die Dichte der MSCs im Gerüst sichtbar. Nach 14 Tagen waren die Zellen auf dem größten Teil der Alvetex-Scaffold-Scheibe verteilt, es verblieb jedoch noch etwas Raum für eine weitere Ausbreitung der Population rings um ihre Peripherie. Eine histologische Analyse offenbarte die mikroskopische Verteilung der 3D-Zellen im Innern des Gerüstes. Die MSCs zeigen eine relativ homogene Verteilung, sind in diesem Stadium jedoch nicht dicht zusammengepackt, weswegen eine Wachstumshemmung durch Zellkontakt vermieden wird. Dies ermöglicht die fortlaufende 3D-Ausbreitung der Zellpopulation über den 14-tägigen Zeitraum der Kultur.

Osteogene Differenzierung

In Alvetex Scaffold gezüchtete MSCs von Ratten wurden nach einem Standardverfahren dazu angeregt, sich zu knochenbildenden Zellen auszudifferenzieren. Es wurde eine Analyse der Ausprägung der mit einer Osteogenese verbundenen Marker durchgeführt und die Differenzierung von knochenbildenden Zellen nachgewiesen (s. Abb. 2). Im Vergleich zu den auf 2D-Kunstoff gewachsenen Zellen lagerten die in Alvetex Scaffold gezüchteten Zellen mehr Calcium ein und unterhielten eine stabile Collagenproduktion, was eher auf eine osteogene als auf eine chondrogene Differenzierung hinweist. Darüber hinaus reichte die Kultur von MSCs in Alvetex Scaffold ohne jeden osteogenen Stimulus aus, um die Einlagerung von Calcium anzuregen (keine Daten angegeben). Die Produktion alkalischer Phosphatase als Reaktion auf die Inkubation in osteogenem Medium war bei den in Alvetex Scaffold gezüchteten Zellen im Vergleich zu den Kulturen auf 2D-Substraten größer. Alkalische Phosphatase ist an der Regulierung der Verfügbarkeit von Phosphat für die Produktion von Hydroxylapatit beteiligt [4]. Daher ist es wahrscheinlich, dass der höhere Gehalt von alkalischer Phosphatase in der 3D-Kultur zu einer größeren Menge von eingelagertem Calcium in Alvetex-Scaffold-Kulturen im Vergleich zu ihren 2D-Pendants beigetragen hat. In den in Alvetex Scaffold ausdifferenzierten Zellen war auch das Osteocalcin außerordentlich erhöht, was mit der Aktivierung der Insulinsignalisierung und der Remodellierung der Knochenmatrix über die in-vivo-Resorption in Zusammenhang steht [5].

Es wurde eine histologische Analyse der MSCs von Ratten durchgeführt, die sich während der 3D-Kultivierung in Alvetex Scaffold zu Knochenzellen ausdifferenziert hatten. Dabei wurden standardmäßige Verfahren zur Gewebefixierung, Bearbeitung und Einfärbung verwendet. In Wachs eingeblockte Schnitte wurden mit verschiedenen Farben bearbeitet, um die Einlagerung verschiedener, mit der Osteogenese verbundener Materialien zu zeigen. Die von-Kossa-Einfärbung wies das Vorhandensein von Calcium-Einlagerungen nach, während die histologische Gegenfärbung das Vorhandensein von Collagen zeigte (s. Abb. 1). Der histologische Nachweis von Markern wie Calcium und Collagen stützt die in Abbildung 2 dargestellten quantitativen Daten, welche auf die Knochenbildung in einer 3D-Kultur unter Verwendung der Alvetex-Scaffold-Technologie hinweisen.

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