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Software für modernes Imaging

Mikroskopie: Von Bildern zu Daten

| Autor/ Redakteur: Horst Wolff*, Renée Dalrymple*, Rebecca Elsässer* / Christian Lüttmann

Gerade in den Neurowissenschaften müssen Anwender verschiedene Mikroskopietechniken nutzen, um die entsprechenden Probeninformationen zu erhalten. Wie gelingt dies, ohne in jeder Technik ein absoluter Experte zu sein, und wie hilft die Software dabei?

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Abb. 1: Übersicht über den mit einem automatisierten Weitfeldmikroskop aufgenommenen Gehirnschnitt der Maus und 3D-Rendering einer Region im Hippocampus (Zellkerne in rot. Hippocampale Neuronen in grün).
Abb. 1: Übersicht über den mit einem automatisierten Weitfeldmikroskop aufgenommenen Gehirnschnitt der Maus und 3D-Rendering einer Region im Hippocampus (Zellkerne in rot. Hippocampale Neuronen in grün).
(Probe: Herms lab, LMU Munich)

Der Blick durch das Okular und dann das manuelle Abzeichnen des Präparats ist lange passé: Ohne Bildverarbeitungssoftware geht in der modernen Mikroskopie nichts mehr. Seit Jahrzehnten wird dabei die Software so optimiert, dass sie mit den Anforderungen der Mikroskopsysteme Schritt hält. Gleichzeitig wurde sie um Funktionen zur Verarbeitung, Analyse, Visualisierung und Speicherung erweitert, um dem Anwender schnellere Antworten auf seine wissenschaftlichen Fragen zu geben. Zusammen mit Hardware-Innovationen hat dies zu einer Generation von Imaging-Systemen geführt, die es ermöglicht, fixierte und lebende Proben länger, tiefer und detaillierter als je zuvor abzubilden. Das Spektrum der Forschungsanwendungen in den Life Sciences ist so breit gefächert, dass es wichtig ist, dass die Softwarepakete optimal darauf abgestimmt sind.

Benutzerfreundlichkeit und Leistung

Anwender erwarten beste Leistung und Benutzerfreundlichkeit für ihre spezifischen experimentellen Bedürfnisse. Die Vielfalt an Instrumenten, Versuchsaufbauten und gewünschten Ergebnissen ist so groß, dass sie mit einem einzigen Softwarepaket kaum zu bewältigen ist. Die meisten kommerziellen Imaging-Software-Suiten bieten dem Anwender daher Werkzeuge zur Entwicklung eigener Module sowie Schnittstellen zu anderen spezialisierten Anwendungslösungen. Die Python-Programmierschnittstelle und der OME TIFF-Export, die in die Mikroskopiesoftware Zeiss ZEN integriert sind, sind Beispiele dafür, wie eine Software mit anderen Anwendungen verbunden werden kann und mit diesen interagiert.

Dennoch bleibt es eine große Herausforderung, Antworten auf wissenschaftliche, immer komplexer werdende Fragen zu finden. Insbesondere dann, wenn Bilder und Daten von mehreren Instrumenten erforderlich sind. Forscher nutzen daher häufig die Hilfe von entsprechenden Imaging Facilities, die sich auf die Lösung schwieriger Anwendungen spezialisiert haben. Im Idealfall bieten diese zentralen Einrichtungen nicht nur den Zugang zu allen erforderlichen bildgebenden Verfahren, sondern auch die Expertise bei der Vorbereitung und Verarbeitung von Proben sowie der Analyse der entsprechenden Bilder und Daten.

Eine große Schwierigkeit bleibt jedoch auch bei gut ausgestatteten Imaging-Facilities: Wie können alle Bilder und Daten, die mit verschiedenen bildgebenden Verfahren – oft mit unterschiedlichen Vergrößerungen und Auflösungen – aufgenommen wurden, miteinander verknüpft werden? Was ist, wenn ein Anwender bestimmte Zellen oder sogar subzelluläre Strukturen in großen Geweben, Modellorganismen oder Organoiden untersuchen muss? Heute ist es allgemeiner Konsens, dass das Wissen, wo sich eine Zelle in Bezug auf benachbarte Zellen befindet, ihre Orientierung im Gewebe und die Entfernung zu anderen Gewebestrukturen, einen deutlich größeren Informationswert bietet als nur die „simple“ Information des Zell-Phänotyps. Benötigt wird quasi eine Karte dieser Zellen in einem größeren Kontext und mit der Möglichkeit, die Zellen auf anderen Imaging-Systemen zu relokalisieren. Wenn man keine Lösung zur Hand hat, die die Regionen von Interesse innerhalb verschiedener Koordinatensysteme auf mehreren Instrumenten verfolgt, kann dies tatsächlich zu einer Aufgabe werden, die dem Finden mehrerer Nadeln in einem Heuhaufen ähnelt.

Software: ein großer Schritt nach vorne

Die Mikroskopiesoftware Zeiss ZEN wurde in den vergangenen Jahren mit Blick auf eine Lösung für solche Probleme weiterentwickelt. Heute bietet sie dem Forscher mehrere einzigartige Funktionen, die die Integration, den Import und Export von Daten aus einer Vielzahl von Imaging-Systemen ermöglichen.

Wie sieht nun ein typischer Workflow aus und wie kann die Verknüpfung von Bildern und Daten die Effizienz steigern? In den strukturellen Neurowissenschaften umfassen die Bereiche in den Proben häufig mehrere Größenskalen. Oftmals müssen Forscher einen ganzen Gewebeschnitt betrachten, um den gewünschten Bereich zu finden, der dann genauer und mit höchstmöglicher Auflösung analysiert wird, um z.B. Dornenfortsätze und die Interaktion zwischen verschiedenen Teilen des Nervensystems zu beobachten.

Verbindungen über Skalen und Modalitäten hinweg

Abb. 2: Maximum Intensitätsprojektion von Dendriten und Dornfortsätzen im Mäuse-Gehirn (Probe wurde in einem 80 x 80 x 75 μm Volumen mit Zeiss Elyra 7 und Lattice SIM aufgenommen). Die Farbkodierung zeigt die Z-Position von Strukturen an.
Abb. 2: Maximum Intensitätsprojektion von Dendriten und Dornfortsätzen im Mäuse-Gehirn (Probe wurde in einem 80 x 80 x 75 μm Volumen mit Zeiss Elyra 7 und Lattice SIM aufgenommen). Die Farbkodierung zeigt die Z-Position von Strukturen an.
(Probe: Herms lab, LMU Munich)

Zeiss ZEN Connect als projektbasierte und probenzentrierte Software-Lösung, integriert Bilder und Metadaten aus verschiedenen Instrumenten und Bereichen in Proben, um diese Arbeitsabläufe zu erleichtern. Sie führt verschiedene bildgebende Verfahren und Auflösungsbereiche zusammen – von großen Sehfeldern mit geringer Vergrößerung, über die hochauflösende, konfokale Lichtmikroskopie bis hin zu elektronenmikroskopischen Daten mit Nanometerauflösung. Abbildung 1 zeigt eine Übersicht über einen Maus-Hirnabschnitt, der mit dem automatisierten Scanner für Objektträger Zeiss Axio Scan.Z1 aufgenommen wurde. Nach einer Übertragung der Probe auf ein Konfokalmikroskop mit Zeiss Airyscan wurde dieses Übersichtsbild genutzt, um die Region von Interesse im Hippocampus zu finden und anschließend in hoher Auflösung zu erfassen. Dadurch konnte eine erhebliche Zeitersparnis erzielt werden, die sonst für die Suche nach der richtigen Stelle aufgewendet worden wäre. Sobald Strukturen jenseits der Beugungsgrenze zur Beantwortung einer wissenschaftlichen Frage benötigt werden, wird der Zeitgewinn noch eklatanter, wenn dieser Ansatz konsequent verfolgt wird. Hochauflösende Bilder von Zeiss Elyra 7 mit Lattice SIM können dann mit einem einzigen Mausklick in einem gewünschten Bereich aufgenommen werden (s. Abb. 2). Die Information, wo sich ein bestimmtes Objekt im Raum mit X-, Y- und Z-Koordinaten befindet, ist jederzeit abrufbar. Später ermöglicht dies, bestimmte Dornfortsätze in einer Übersichtskarte des Maushirns zu finden.

Informationen aus den Imaging-Daten extrahieren

Abb.3A: Rohdaten-Fluoreszenzbild (links) und KI-Segmentierung (Mitte) eines einzelnen Schnitts des z-Stapels aus Abb. 2 (Hintergrund cyan, Dendriten orange, Dornenfortsätze magentafarben). Der rechte Bereich zeigt das KI-Ergebnis eines andere Schnittes des z-Stapels (Dendriten in grün, Hintergrund in cyan und Dornenfortsätze in rot).
Abb.3A: Rohdaten-Fluoreszenzbild (links) und KI-Segmentierung (Mitte) eines einzelnen Schnitts des z-Stapels aus Abb. 2 (Hintergrund cyan, Dendriten orange, Dornenfortsätze magentafarben). Der rechte Bereich zeigt das KI-Ergebnis eines andere Schnittes des z-Stapels (Dendriten in grün, Hintergrund in cyan und Dornenfortsätze in rot).
(Probe: Herms lab, LMU Munich)

Sehr oft ist jedoch das Bild allein nicht die Antwort auf die analytische Frage. So hilfreich mikroskopische Bilder auch sein mögen – ihr eigentlicher Wert liegt in den Daten, die sie liefern. Dazu ist eine genaue Segmentierung der Bilder erforderlich – derzeit eine der größten Herausforderungen in der mikroskopischen Bildanalyse. Die Segmentierung bildet die Grundlage für alle nachfolgenden Schritte der Bildanalyse und Datenextraktion. Zeiss ZEN Intellesis nutzt dabei Deep Learning- und Python-Funktionalitäten, um jedem Anwender robuste und reproduzierbare Segmentierungsergebnisse zu ermöglichen. Nachdem die Software einmal trainiert wurde, segmentiert sie automatisch Stapel von Hunderten von Bildern. Dazu müssen nur die gewünschten Klassen definiert (z.B. Dendriten und Dornfortsätze) und dann einige repräsentative Objekte jeder Klasse markiert werden. Hiermit wird das Deep-Learning-Modell trainiert (s. Abb. 3A und 3B). Wenn das Ergebnis des Deep Learnings zufriedenstellend ist, wird das Modell angewendet, um vollständige Datensätze zu segmentieren und zu analysieren. Diese Segmentierung ist vollständig in den Bildanalyse-Assistenten der Zeiss ZEN Imaging-Software integriert. Die Integration in das ZEN-Messsystem stellt sicher, dass alle wertvollen Metadaten miteinander verbunden bleiben und für weitere Verarbeitungsschritte zur Verfügung stehen. Dies spart Zeit und minimiert einen persönlichen Einfluss des Anwenders.

Abb.3B: z-Stapel von 160 Schnitten mit der KI von 3A
Abb.3B: z-Stapel von 160 Schnitten mit der KI von 3A
(Bild: Herms lab, LMU Munich)

Der beschriebene Ansatz integriert Bilder von einem Scanner für Objektträger, einem Konfokalmikroskop und einem superauflösenden Instrument sowie einen Deep-Learning-Ansatz zur Bildsegmentierung. Auf diese Weise werden unterschiedliche Mikroskopie-Techniken miteinander verknüpft, jedoch auch deren Anwender, die Experten für die Bedienung eines Instruments sind, aber weniger gut mit anderen Imaging-Systemen vertraut sind. Mit einem vernetzten Ansatz hat der am besten ausgebildete Bediener eines bestimmten Instruments immer die notwendigen Informationen, um genau die Bilder aufzunehmen, die benötigt werden. Dies macht es extrem einfach, innerhalb einer Gruppe von Forschern an einem Mikroskopie-Workflow zusammenzuarbeiten. Es ist nicht einmal ein Problem, wenn ein Schritt des gesamten Workflows auf einem System eines anderen Herstellers durchgeführt wird. Solange extern aufgenommene Bilder in einem Format vorliegen, das von den bekannten Bioformats abgedeckt wird, können alle Bilder und Daten integriert und im Kontext dargestellt werden. Zeiss ZEN speichert sogar die Metadaten der Fremdbilder. Mit einem einzigen Mausklick hat der Anwender genau die Bilder zur Hand, die er benötigt.

Zusammenfassung: Bilder und Daten verknüpfen

Um in allen wissenschaftlichen Disziplinen so viele Informationen wie möglich über die Proben zu erhalten, müssen Anwender Bildgebungsverfahren, Bilder, Daten und Instrumente miteinander verbinden. Lösungen, die den Informationsfluss von Bildern zu Daten ermöglichen, werden immer wichtiger, um den wissenschaftlichen Output zu erhöhen. Dies kann genutzt werden, um die Produktivität zu steigern, insbesondere in Multiuser-Laboren und Imaging Facilities.

* Dr. H. Wolff, R. Dalrymple, Rebecca Elsässer, Zeiss Research Microscopy Solutions, 07745 Jena

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