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Dynamische Lichtstreuung

Mittels Dynamischer Lichtstreuung Aggregate von therapeutischen Proteinen aufspüren

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Welche Effekte zeigten die DLS-Messungen?

Die untersuchten Proben zeigten in der DLS-Messung einen veränderten, deutlich nach rechts verschobenen Verlauf der Messkurven wie auf Abbildung 1 zu sehen ist. Dieser Effekt ist auf die Bildung von Aggregaten zurückzuführen. Man kann sich das ungefähr so vorstellen: Gegenüber einer reinen Monomerlösung ist durch die Anwesenheit von Aggregaten die „durchschnittliche“ Größe der Teilchen, welche die DLS misst, etwas erhöht. Das bewirkt eine „Rechtsverschiebung“ der Kurve wie in der Abbildung gezeigt.

Auch das verwendete Lösemittel wirkt sich auf das Aggregationsverhalten der Probe aus. Man erkennt, dass der in Phosphatpuffer (PBS) gelöste Antikörper nach Lyophilisierung deutlich weniger aggregiert ist als das in Sucrose-haltigem Puffer gemessene Präparat.

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In Abbildung 2 wird dargestellt, dass die Aggregate im Vergleich zu den Monomerfraktionen bezogen auf ihren Massenanteil ein wesentlich intensiveres Streulicht erzeugen. Aus der so genannten Prozent-Massen-Auswertung, einer speziellen Berechnungsfunktion der Dynamics-Software, ergibt sich für die aggregierten Antikörper in den beiden Präparaten, dass ihr Anteil an der Gesamtmasse lediglich 0,4 bzw. 1,2 % beträgt. Dennoch sind sie eindeutig nachweisbar. Dieser Befund verdeutlicht auch die hohe Empfindlichkeit der Methode.

Die thermische Stabilität einer Antikörperlösung lässt sich ebenfalls sehr gut mittels DLS untersuchen. Dazu wird die Probe einem ansteigenden Temperaturprofil ausgesetzt und dabei das Verhalten der Moleküle betrachtet.

In den Abbildungen 3 und 4 sind Messungen der Schmelzpunkte zweier Antikörper in verschiedenen Pufferlösungen aufgetragen. Der Beginn des Schmelzens ist durch die senkrechte gestrichelte Linie markiert. Während IgG_1 seine Stabilität bis zu einer Temperatur von knapp 67 °C beibehält, verliert IgG_2 schon bei etwa 61 °C seine ursprüngliche Struktur. Die Molekülradien zeigen, dass die hoch geordnete Struktur des Antikörperproteins, die aus energetischen Gründen nicht mehr aufrechterhalten werden kann, verloren geht. Der Antikörper geht dabei in einen quasi ungeordneten Zustand über. Er dehnt sich räumlich stärker aus, und die Lichtstreuung misst einen größeren hydrodynamischen Radius der Moleküle.

Sofern das Molekulargewicht der Makromoleküle bekannt ist, lassen sich auch noch weiter gehende Aussagen zu ihrem Verhalten treffen. Bestimmt man die Molekulargewichte allerdings allein mittels DLS, so werden diese nicht absolut, sondern lediglich anhand der Beziehung zwischen Radius und Masse berechnet. Die Ergebnisse sind deswegen mit einer gewissen Unsicherheit der Bestimmung behaftet, denn die aus dem hydrodynamischen Radius berechneten Daten hängen von der Tertiärstruktur des Proteins ab. Doch dieser Problematik kann man abhelfen: Das Dynapro Nanostar verwendet als einziges verfügbares DLS-Instrument eine zusätzliche 90°-Streulichtdiode für die Statische Lichtstreuung (SLS). Damit wird das Molekulargewicht absolut aus der Gesamtmenge des gestreuten Lichts bestimmt. Dies erfolgt allein aus den Messdaten und ohne weitere Annahmen über die Gestalt des Moleküls. Dadurch kann das Instrument simultan hydrodynamische Radien durch DLS und absolute Molekülgewichte mittels SLS messen. Mithilfe entsprechender Zusatzfunktionen der Dynamics-Software bekommt man auf diese Weise einen wertvollen Zugewinn an Informationen.

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