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Mikrodissektion Molekulare Pathologie mithilfe der Mikrodissektion

Autor / Redakteur: Monika Stich und Renate Burgemeister* / Olaf Spörkel

Die Erforschung neuer Diagnose- und Therapieverfahren für den klinischen Einsatz umfasst ein breites Spektrum moderner molekularbiologischer und immunologischer Methoden. Im Zentrum der Untersuchungen zu Ursachen und Verlauf von Krankheiten steht die Molekulare Pathologie.

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1 Prinzip der Lasermikrodissektion (LCM).
1 Prinzip der Lasermikrodissektion (LCM).
( Bild: Carl Zeiss MicroImaging GmbH )

Eine definierte und homogene Ausgangsprobe ist die grundlegende Voraussetzung für aussagekräftige Ergebnisse in der Molekularpathologie. Mit der Non-contact LCM – Laser Capture Microdissection - lässt sich aus histologischen Proben definiertes Untersuchungsmaterial selektieren und einer molekulargenetischen Untersuchung zuführen.

Definiertes Ausgangsmaterial

In der Tumorpathologie werden Mutationen, Amplifikationen, Rearrangements, sowie veränderte Expressionsraten von Onkogenen, Tumorsuppressorgenen und anderen tumorassoziierten Genen untersucht. Ziel dieser Analysen ist eine Klassifizierung des Tumors und die Bestimmung der Klonalität, um eine Prognose und Therapieempfehlung geben zu können.

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Tumore bestehen in der Regel aus einer heterogenen Mischung von neoplastischen und unveränderten Zellen. Maligne Zellen repräsentieren oft nur eine geringe Population in einer Gewebeprobe. Das bislang am häufigsten verwendete Vorgehen zur Untersuchung des Tumors trägt diesem Umstand jedoch nicht Rechnung. Wird das nicht-selektierte Tumormaterial als Bulkmaterial im Ganzen untersucht, kann die Genexpression der Tumorzellen im Ergebnis der Nicht-Tumorzellen untergehen und verfälschte Daten liefern. Hier kommt die Laser-Mikrodissektion zum Einsatz. Mittels LCM wird erreicht, dass ausschließlich das für die molekularbiologische Analyse selektierte Probenmaterial zur Verfügung steht. Dies führt zu signifikanten und reproduzierbaren Resultaten. Die Entwicklung von Protokollen zum sensitiven DNA- und RNA- Nachweis aus wenigen mikrodissektierten Zellen und zur Amplifikation geringer Nukleinsäuremengen tragen zum Fortschritt der diagnostischen Forschung bei.

Non-contact Laser Capture Microdissection (LCM)

Die berührungslose Laser-Mikrodissektion, realisiert im PALM MicroBeam von Carl Zeiss, hat sich als Standardtechnologie in Forschung und Klinik etabliert. Eingekoppelt in ein Forschungsmikroskop wird ein Laserstrahl durch ein Objektiv mit hoher numerischer Apertur fokussiert. Die Methode ermöglicht das exakte Ausschneiden von Zellarealen, einzelnen Zellen oder auch Zellkompartimenten. Je nach verwendetem Objektiv werden Schnittbreiten unter einem Mikrometer erreicht. Ohne mechanischen Kontakt und nur durch die Kraft des fokussierten Lichts werden die selektierten Zellen separiert und durch einen gezielten Laserpuls in ein Auffanggefäß, z.B. in den Deckel eines Mikrozentrifugenröhrchens, transportiert (Abb.1).

Als Ausgangsmaterial eignen sich Paraffin-fixierte oder gefrorene Präparate, Cytospins, Zellausstriche, Metaphase-Chromosomen oder Zellkulturen, aus denen lebende Zellen für eine anschließende klonale Expansion gewonnen werden können. Durch geeignete Färbung (Abb. 2) oder Fluoreszenzmarkierung wird die Selektion der Zielzellen vereinfacht. Die im Auffanggefäß gesammelten Zellen können unmittelbar den anschließenden Analysen zugeführt werden.

Automatisierte Bilderkennung

Das im PALM MicroBeam integrierte Mikroskop, der AxioObserver von Carl Zeiss, ist ein inverses Forschungsmikroskop mit Fluoreszenzausstattung inklusive hochauflösender Kamera und Bilderkennungssoftware. Die AxioVision Software ermöglicht ein schnelles Detektieren der Zielzellen. Bis zu drei Objektträger können nebeneinander gescannt und die vom Anwender definierten ROI (Regions of interest) automatisch gefunden werden (Abb. 3). Suchkriterien können spezifisch für jedes Präparat interaktiv in einem Programm gespeichert werden. Durch die Schnittstelle zur PALM RoboSoftware werden anschließend alle selektierten Zellareale automatisch mittels LCM in bis zu 96 getrennte Auffanggefäße transportiert.

Der Workflow von automatisierter Detektion über softwaregesteuerte Lasermikrodissektion mit anschließender Analyse der Biomoleküle garantiert einen effizienten Ablauf, der besonders in der Routine der klinischen Pathologie von Vorteil ist.

Digital Slide

Soll das komplette Präparat für den Zweitbefund jederzeit zugänglich sein, kann es vor der Mikrodissektion eingescannt werden. Mit der Digital Slide -Technologie von Carl Zeiss (Abb. 4) werden die histologischen Präparate zur Archivierung digitalisiert. Die gesamte auf dem Objektträger befindliche Probe wird gescannt und die Daten auf einem Slide-Server gespeichert. Auf diese Weise steht das unveränderte Präparat nach der Mikrodissektion digital zur Verfügung. Die Telekonsultations-Software ermöglicht zusätzlich die gemeinsame Diskussion am konkreten Fall.

Alte Präparate – Neue Erkenntnisse

Die non-contact LCM zeichnet sich durch die Möglichkeit aus, Archivmaterial zu bearbeiten. Jahrelang gelagerte Gewebeschnitte bergen oft diagnostische Geheimnisse, die durch neue Erkenntnisse der Forschung gelüftet werden können. Die archivierten Präparate können nun einfach und bequem für die Mikrodissektion genutzt werden. Nach Entfernen des Deckglases lassen sich Areale mikrodissektieren und molekulargenetisch analysieren. Damit stehen auch sehr alte Proben für Nachuntersuchungen mit neuen Methoden ohne großen Aufwand zur Verfügung.

Die Pathologie des 21. Jahrhunderts wird nicht nur Diagnosen stellen, sondern Zusatzinformationen liefern, die eine individualisierte Therapie ermöglichen. Die Lasermikrodissektion wird als innovative Technologie diesen Fortschritt beschleunigen.

* M. Stich und Dr. R. Burgemeister, Carl Zeiss MicroImaging GmbH, 81379 München

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