Monoklonale Antikörper: Forscherteam entdeckt Ursachen unerwünschter Nebenreaktivitäten

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Technische Universität Braunschweig

Die in der Studie untersuchten Hybridome wurden nach strengen Regeln ausgewählt, um zu vermeiden, dass nur „problematische“ Klone sequenziert wurden. Die meisten der untersuchten Klone wurden wirtschaftlich verwertet, der Datensatz repräsentiert also einen typischen Querschnitt momentan verwendeter monoklonaler Antikörper. Die Sequenzierungsergebnisse wurden auch nicht von der verwendeten Methode (entweder PCR-Klonierung mit diversen Primersätzen oder Next-Generation Sequencing) beeinflusst: beide ergaben ähnliche Ergebnisse. Rattenhyb­ridome waren allerdings deutlich häufiger genetisch heterogen: 78% (29 von 37) exprimierten zusätzliche produktive Ketten, während solche in 20% der Maus-Hybridome (29 von 146) nachweisbar waren.

Insgesamt muss nach diesen Ergebnissen davon ausgegangen werden, dass ein signifikanter Anteil der derzeit verwendeten monoklonalen Antikörper ein Gemisch verschiedener Immunglobuline enthält und somit nicht monospezifisch ist.

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Ursachen: Hybridomzellen sind keine B-Lymphozyten

Die Sequenzierungsergebnisse ergaben zahlreiche Hinweise auf den Ursprung der zusätzlichen produktiven Antikörper-mRNAs. Die meisten der Klone mit zusätzlichen mRNAs produzieren lediglich eine zusätzliche Kette (55 von 59). Dies belegte, dass die meisten der beo­bachteten zusätzlichen produktiven Sequenzen nicht aus einer Verunreinigung mit einem anderen Hybridom stammen konnten, also wirklich reine, d.h. korrekt subklonierte monoklonale Zelllinien vorlagen. Ansonsten hätte man auch eine zweite schwere Kette gefunden. Woher stammen aber nun die verschiedenen Antikörper-mRNAs in der gleichen Zelle? Hybridome sind direkt nach der Fusion zunächst tetraploid und haben deshalb vier verschiedene Sätze von Antikörperallelen. Auch ist schon lange bekannt, dass stabile Hybridome sehr unterschiedliche Chromosomenzahlen aufweisen können. Das gefundene Spektrum reicht von Verlusten zahlreicher Chromosomen (Aneuploidie) bis zur Amplifikation mit bis zu 50 zusätzlichen Chromosomen.

Im Kontext des Immunsystems sind Rekombination und Expression der Antikörpergene in der B-Zelle streng reguliert. Die Fusion mit der Tumorzelle und Kultivierung in vitro könnte aber dazu führen, dass vorher nichtproduktive Allele wieder aktiviert oder zusätzliche Allele neu arrangiert werden. Die verwendeten Myelom-Fusionspartner sind zudem selbst Antikörper-produzierende Krebszellen. Aber auch zahlreiche leichte Ketten, welche nicht dem Myelom-Fusionspartner zugeordnet werden konnten, wurden bei der Sequenzierung identifiziert. Dies kann zum Beispiel durch Fusion einer Myelomzelle mit mehr als einer B-Zelle verursacht worden sein, oder durch das oben erwähnte Wiedereinschalten weiterer Allele. Als dritte Quelle von genetischer Heterogenität wurden Punktmutationen und kleine Deletionen/Insertionen beobachtet. Solche könnten zum Beispiel während einer längeren Zellkulturkampagne einer zunächst homogenen Ausgangspopulation akkumulieren. Die verschiedenen Ursachen für die vorgefundene genetische Heterogenität bei den produzierten Antikörper-mRNA sind überdies unabhängig voneinander und könnten somit in beliebigen Kombinationen auftreten.

Zusätzliche Ketten verringern Qualität der Ergebnisse

Die nachteiligen Effekte der mRNA-Heterogenität in Hybridomklonen war auch auf Proteinebene nachweisbar – die Sekretion eines Antikörpergemisches hatte Auswirkungen auf die Funktion. In verschiedenen Assays wurde die Bindung von gereinigtem IgG aus Hybridomüberständen direkt mit der Bindung von rekombinant hergestellten, sequenzdefinierten Antikörpern aus den gleichen Hybridomen verglichen. Die Ergebnisse belegen eindrucksvoll, wie die zusätzlichen Antikörperketten zum einen die gewünschte Reaktion abschwächen, da sie die „korrekten“ IgGs (vgl. Abb. 2) verdünnen, und in einigen Fällen auch direkt zu zusätzlichen falsch-positiven Reaktionen bzw. einer Erhöhung des Hintergrunds führten.

Der Ausweg: Rekombinante Antikörper

Diese Probleme durch genetische Heterogenität von Hybridomen lassen sich durch rekombinante Produktion von IgG aus definierten Sequenzen beseitigen. Bei therapeutisch verwendeten monoklonalen Antikörpern ist dieses Vorgehen daher längst Standard. Rekombinante Antikörper werden jedoch zunehmend auch für die Forschung erzeugt. Einige Hersteller haben ihr Sortiment bereits weitgehend auf sequenzdefinierte rekombinante Antikörper umgestellt oder erweitern ihr Sortiment mit Antikörpern aus dem Phagendisplay, welche per Definition genetisch homogen sind. Die aktuellen technischen Entwicklungen beim Phagendisplay und das Auslaufen restriktiver Patente machen es heute möglich, auch Forschungsantikörper von Anfang an rekombinant herzustellen. Solche sequenzdefinierten Antikörperfraktionen haben neben ihren besser definierten Reaktivitätsprofilen und ihrer unlimitierten Reproduzierbarkeit noch einem weiteren Vorteil: die für die Hybridomerzeugung notwendigen Tierversuche können komplett vermieden werden.

Originalveröffentlichung: Bradbury, A.R.M., Dübel, S. et al. (2018) When monoclonal antibodies are not monospecific: hybridomas frequently express additional functional variable regions. mAbs 10, https://doi.org/10.1080/19420862.2018.1445456

* Prof. Dr. Stefan Dübel Technische Universität Braunschweig, Institut für Biochemie, Biotechnologie und Bioinformatik, 38106 Braunschweig

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