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Überraschende Assays Monoklonale Antikörper: Forscherteam entdeckt Ursachen unerwünschter Nebenreaktivitäten

Autor / Redakteur: Prof. Dr. Stefan Dübel* / Dr. Ilka Ottleben

Monoklonale Antikörper haben Forschung und Diagnostik revolutioniert. Dennoch werden bei ihnen immer wieder unerwartete und unerwünschte Bindungs­aktivitäten beobachtet. Ein internationales Forschungskonsortium hat nun genetische Ursachen gefunden, die solche Reaktivitäten erklären können.

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Monoklonale Antikörper haben Forschung und Diagnostik revolutioniert. Dennoch werden immer wieder unerwartete und unerwünschte Bindungsaktivitäten monoklonaler Antikörper beobachtet.
Monoklonale Antikörper haben Forschung und Diagnostik revolutioniert. Dennoch werden immer wieder unerwartete und unerwünschte Bindungsaktivitäten monoklonaler Antikörper beobachtet.
(Bild: ©ustas - stock.adobe.com)

Unzählige Forscher haben diese Situation schon erlebt: ein im Katalog als spezifisch beschriebener monoklonaler Antikörper erzeugt gänzlich unerwartete Reaktionsmuster im eigenen Versuch. In den letzten Jahren gab es bereits zahlreiche Publikationen, die die mangelnde Qualität vieler Katalog-Antikörper anprangerten. So fand man bei der systematischen Untersuchung von mehr als 5000 Antikörpern nur bei der Hälfte Reaktivität mit dem gewünschten Antigen. Mangelnde Qualitätskontrolle oder unzureichende Charakterisierung sind aber nicht in allen Fällen dafür verantwortlich. Oft liegt der Grund einfach darin, dass ein Antikörper sein Antigen nicht automatisch in allen Formen und Präparaten gleich gut erkennt. Viele Antikörper erkennen zum Beispiel entweder nur denaturiertes oder nur nativ gefaltetes Antigen, oder binden nur nach einer bestimmten Fixierung. Unterschiedliche Präparate und Assays bieten aber auch stets ein anderes Gemisch von Proteinen neben dem nachzuweisenden Antigen an, mit dem der Antikörper potenziell kreuzreagieren kann. Deshalb sind Befunde zu unerwünschten Nebenreaktionen aus einem Assaytyp nicht einfach auf einen anderen übertragbar.

Zudem gibt es systematische Ursachen, welche in der Methode zur Erzeugung der Reagenzien begründet sind. Bei polyklonalen Antikörpern (Antiseren) sind viele Nebenreaktionen einfach erklärbar. Polyklonale Antikörper bestehen in der Regel nicht nur aus den Immunglobulin-Molekülen, welche nach der Immunisierung gegen das dabei verwendete Antigen gebildet wurden, sondern enthalten die im Tierserum ansonsten vorhandenen Antikörper. Diese Mischung ist zudem in jedem Tier unterschiedlich. Dies kompliziert die Vergleichbarkeit von Daten entsprechender Antikörper gegen das gleiche Antigen, wenn sie aus verschiedenen Tieren stammen.

Hybridomtechnologie: Nobelpreis-würdiger Durchbruch

Der wichtigste Durchbruch zur Verbesserung der Spezifität war deshalb die Nobelpreis-gewürdigte Hybridomtechnologie von George Köhler und Cesar Milstein. Dabei werden spezifische B-Lymphozyten, welche nach Immunisierung mit dem gewünschten Antigen in der Maus oder der Ratte entstehen, durch Zellfusion mit Krebszellen (Myelomen) unsterblich gemacht. Nach Selektion von Klonen, die aus einzelnen Zellen solcher Fusionen („Hybridome“) wachsen, können aus deren Überständen monoklonale Antikörper gewonnen werden. Da von einer einzelnen definierten und klonalen Zelllinie produziert, gingen viele Nutzer davon aus, dass monoklonale Antikörper nur ein einziges definiertes Antikörperprotein enthalten. Dass dies nicht so ist, war jedoch bereits den Erfindern Köhler und Milstein klar und sie betrieben einigen Aufwand, um die Heterogenität der Antikörperketten aus Hybridomen zu reduzieren.

Dies geriet jedoch bald in Vergessenheit, und zur Erklärung unerwarteter Reaktivitäten bei monoklonalen Antikörpern waren auch andere Ursachen bekannt. So sind Beispiele beschrieben, bei denen die Antigenbindestelle eines bestimmten Antikörpers ein gänzlich anderes Protein als das Antigen, gegen das dieser erzeugt wurde, binden konnte. Dies ist dadurch möglich, dass das kreuzreagierende Antigen an einer Stelle über zufällig strukturell ähnliche Regionen verfügt, so genannte Mimotope. Eine weitere Erklärungsmöglichkeit war die nicht ausreichend stringente Subklonierung nach der Hybridomfusion. Ist die Hybridom-Zellkultur nicht völlig klonal, sondern mit einem anderen Hybridom kontaminiert, findet man Immunglobuline verschiedener Spezifität im Überstand. Doch es gab auch Fälle, wo trotz sehr sorgfältiger und mehrfacher Subklonierung die Nebenreaktivitäten nicht beseitigt werden konnten.

In einer internationalen multizentrischen Studie von 16 Labors aus sechs Ländern wurden nun die genetischen Ursachen für die Produktion verschiedener Antikörper durch einen einzelnen Hybridomklon erstmals systematisch analysiert. Die Ergebnisse der Sequenzierung von Antikörper-cDNA aus 185 verschiedenen Hybridomen erbrachte Überraschendes: etwa ein Drittel der Klone exprimierte mehr als eine produktive mRNA für mindestens eine der beiden Polypeptidketten, aus denen ein IgG besteht (s. Abb. 1).

Monoklonalität gewährleistet nicht Monospezifität

Zum größten Teil waren dies die leichten Ketten. Es zeigte sich, dass ein Drittel der untersuchten Hybridome ein heterogenes Proteingemisch in den Überstand sekretiert und somit Antikörpermischungen mit mindestens einer zusätzlichen undefinierten Spezifität produzieren (s. Abb. 2). Einige Hybridome, in denen eine zusätzliche leichte und schwere Kette gefunden wurden, produzieren sogar zehn verschiedene Protein-Spezies, welche vier strukturell unterschiedliche Antigenbindungsstellen in verschiedenen Kombinationen enthalten.

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