HPLC/MS-Multimethode Mykotoxine: die unterschätzte Gefahr

Produktiv ist, wer mit geringem Aufwand viel erreicht. Das auf die Untersuchung von Lebensmitteln und Umweltproben spezialisierte Auftragslabor Tela hat jüngst eine HPLC/MS-Multimethode zum Nachweis neun verschiedener Mykotoxine entwickelt und erfolgreich in die Routineanalytik eingeführt.

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Die lateinische Bezeichnung mag den Laien an Asterix und Obelix erinnern, die Jagd machen auf römische Legionäre. Doch Kenner wissen: Einem Schimmelpilz namens Aspergillus parasiticus oder Aspergillus flavus kommt man weder mit einem Zaubertrank bei noch mit unbändiger Körperkraft; diese braucht man allenfalls, um das Ekelgefühl im Zaum zu halten, das einen befällt, wird man eines Schimmelpilzes ansichtig, der über Wochen in einer vergessenen Brotdose gewuchert ist.

Der Anblick eines unkontrolliert gewachsenen Schimmelpilzes ist selten appetitlich, dennoch ist er harmlos. Gefährliches Potenzial besitzt vielmehr das, was das Auge nicht sieht: Im Zuge ihres Stoffwechsels produzieren Schimmelpilze Gifte, so genannte Mykotoxine, denen eine chronische und akute Toxizität zugeschrieben wird, teilweise auch krebserregende, erbgutverändernde und hormonaktive Eigenschaften [1].

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Mykotoxine – die Dosis macht das Gift

Wer Getreide, Nüsse, Früchte, Gewürze und andere Feldfrüchte verarbeitet, wird mit dem Auftreten von Schimmelpilzen rechnen müssen. Schimmel ist ein geradezu ubiquitäres Problem, das sich nicht verhindern, höchstens eindämmen lässt. Dieser Tatsache trägt der Gesetzgeber Rechnung, indem er hinsichtlich der Toxizität Höchstmengen für Mykotoxine festgelegt hat [2]:

• Aflatoxin B1: 8,0 μg/kg (Erdnüsse), 0,1 μg/kg (Säuglingsnahrung); Summe der Aflatoxine B1, B2, G1 und G2: 15 μg/kg (Erdnüsse), 4,0 μg/kg (Getreide)

• Ochratoxin A: 10 µg/kg (Kaffee, Rosinen), 0,5 μg/kg (Säuglingsnahrung)

• Zearalenon: 200 μg/kg (Mais), 20 μg/kg (Säuglingsnahrung)

• T-2-/HT-2-Toxin: noch nicht festgelegt

• Fumonisin B1: 2000 μg/kg (Mais), 200 μg/kg (Säuglingsnahrung)

Problem der klassischen Mykotoxinanalytik

Die Vorgabe von Höchstmengen impliziert die Anwendung geeigneter Analyseverfahren und -methoden, mit denen sich die Einhaltung der gesetzlichen Vorgaben überprüfen lässt. Klassischerweise, sprich gemäß §64 Lebens- und Futtermittelgesetzbuch (LFGB), erfolgt der Nachweis von Mykotoxinen gruppenweise mittels HPLC und Fluoreszenzdetektion. Vor der Bestimmung erfolgt eine Aufreinigung durch Immunoaffinitätskartuschen. Und teilweise, namentlich bei Aflatoxinen und Fumonisin, ist eine Derivatisierung durchzuführen. Eine HPLC-MS/MS-Methodik ist ausschließlich bei T-2 und HT-2 normiert.

Die herkömmliche Vorgehensweise beim Nachweis von Mykotoxinen ist wirksam, birgt allerdings Optimierungspotenzial in puncto Produktivität. Der Einsatz von Immunoaffinitätskartuschen zwecks Aufreinigung der Proben etwa ist recht teuer. Hinzu kommt der zeit- und arbeitsintensive Aufreinigungsschritt, zumal die verschiedenen Mykotoxine in Gruppen analysiert werden.

Optimierungspotenziale erschließen

Nach genauer Betrachtung der Methode erschien es denkbar, die Effizienz und Produktivität der Mykotoxinanalytik signifikant zu steigern. Optimierungspotenzial wurde an verschiedenen Stellen der Methode ausfindig gemacht. Unter anderem liegt es nahe, einen Großteil der Mykotoxine in einer Nachweismethode zusammenzufassen. Und statt die Proben zur Aufreinigung über teure Immunoaffinitätskartuschen laufen zu lassen, könnte eine vergleichsweise günstige Festphasenextraktion zu ähnlichen Resultaten führen. Weiteres Optimierungspotenzial findet sich in der Vorgehensweise, da sich sämtliche Schritte der Probenvorbereitung auf einem Standardautosampler automatisieren lassen, was zu einer Arbeitserleichterung führen sollte. Nicht zuletzt erschien es möglich, Spezifität und Empfindlichkeit der Messung zu erhöhen, würde die Fluoreszenzdetektion durch eine MS/MS-Detektion ersetzt.

Nach einer hinreichenden Anzahl an Experimenten stand die Multimethode zum Nachweis der Mykotoxine Aflatoxin B1, B2, G1 und G2, Ochratoxin A (OTA), Zearalenon (ZEA), T-2- und HT-2-Toxin und Fumonisin B1. Für die Analyse verwendet wurde ein System bestehend aus einer Agilent 1290 HPLC mit 6495-Triple-Quadrupol-Massenspektrometer von Agilent Technologies in Kombination mit einem Gerstel-Multi-Purpose-Sampler (MPS) in der Dual-Head-Ausführung, also ausgestattet mit zwei Türmen, um für die verschiedenen Arbeitsschritte im Rahmen der Probenvorbereitung und Probenaufgabe diverse Werkzeuge verfügbar zu haben (s. Abb. 2).

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