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Steroid-Hormone

Nachweis von Steroid-Hormonen in Wasser mittels HPLC-MS/MS

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Wahl der geeigneten Analysetechnik

Für die Bestimmung hormonell wirksamer Substanzen werden bisher sowohl GC- als auch HPLC-Verfahren in der Routine genutzt. GC-Verfahren erfordern für Steroide meist zusätzlich einen Derivatisierungsschritt, um die Polarität der Analyten den Bedingungen der Gaschromatographie (GC-Säule) anzupassen [7]. Leider wirken sich aufwändige Verfahrensschritte häufig negativ auf die Reproduzierbarkeit aus und damit auf die Verlässlichkeit des Gesamtverfahrens. Bestimmungsgrenzen im unteren ng/L-Bereich lassen sich darüber hinaus mittels GC oft nur erreichen, wenn große Probenvolumina (z.B. 1000 mL) eingesetzt werden. Hiermit wird eine starke Aufkonzentrierung der Zielkomponenten angestrebt. Um Anreicherungsfaktoren von 1:1000 bis 1:5000 zu erhalten, werden in der Regel entweder die Flüssig-/Flüssig-Extrakton (LLE) oder die Festphasenextraktion (SPE) eingesetzt. Diese Verfahren sind jedoch sehr zeit-, personal- sowie kostenintensiv.

Ziel der Arbeit war es, auf der Basis der HPLC ein robustes und schnelles Verfahren mit einem möglichst hohen Automatisierungsgrad zu entwickeln. Die Anreicherung von größeren Probenvolumina sollte vermieden werden. Neben Anregungen aus der Literatur [8] bildeten die sehr guten eigenen Erfahrungen mit dem Direktinjektionsverfahren in Kombination mit einer HPLC-MS/MS hierbei die Basis für weitere Entwicklungen [9, 10] eines Verfahrens zur Bestimmung ausgewählter Steroide in Trink-, Grund- und Oberflächenwässern. Um möglichst niedrige Bestimmungsgrenzen zu erreichen, wurde neben der Direktinjektion auch ein Verfahren der Online-Anreicherung (Online-SPE) entwickelt.

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Direktinjektion

Zunächst wurde für sechs ausgewählte Hormone (s. Tabelle 1) eine HPLC-MS/MS-Methode erarbeitet. Die chromatographischen und spektroskopischen Betriebsbedingungen wurden an einer Waters Acquity UPLC Xevo TQ-S optimiert und sind in den Tabellen 2 und 3 zusammengefasst. Die Injektion wurde hinsichtlich variabler Aufgabevolumina optimiert. Es zeigte sich, dass auch große Injektionsvolumina von bis zu 250 µL unproblematisch sind, eine weitere Steigerung bis zu 1000 µL aber keine nennenswerten Vorteile bieten. Die Direktinjektion erfordert prinzipiell keine Probenvorbereitung, da auf einen Anreicherungsschritt zur Aufkonzentrierung der Analyten verzichtet wird. Für schwebstoffhaltige Proben (z.B. Oberflächenwasserproben) empfiehlt sich jedoch eine vorherige Filtration der Wasserprobe mittels Glasfaserfilter, um Verstopfungen des Injektionssystems auszuschließen. Dies lässt sich bequem mittels Spritzenvorsatzfilter unmittelbar vor der Bestückung des Probengebers erledigen. Die Methode ist vollständig automatisierbar. Im Rahmen der Validierungsexperimente wurden im Konzentrationsbereich von 2 bis 100 ng/L sehr gute Ergebnisse zur Linearität und Verfahrensreproduzierbarkeit erreicht. Standardadditionsversuche mit dotierten Wässern unterschiedlicher Matrix konnten die Eignung des Verfahrens für die Untersuchung von Oberflächenwässern belegen. Für alle untersuchten Stoffe lagen die Bestimmungsgrenzen stets mindestens zwischen 5 ng/L und 10 ng/L (s. Tabelle 4 und 5).

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