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Steroid-Hormone

Nachweis von Steroid-Hormonen in Wasser mittels HPLC-MS/MS

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Online-Anreicherung der Hormon-Steroide

Aufbauend auf den Ergebnissen des Direktinjektionsverfahrens wurde zur Verbesserung der Bestimmungsgrenzen ein Online-SPE-Verfahren entwickelt. Das System der Firma Waters bot hierzu mit seinen beiden unabhängigen Pumpensystemen und mehreren 6-Wege-Schaltventilen eine geeignete Basis (s. Abb. 1d). Mit dem zusätzlichen Pumpensystem (QSM = quaternary solvent manager) erfolgte die Online-Anreicherung, während die binäre Pumpe (BSM = binary solvent manager) die Elution und Chromatographie (UPLC) durchführte. Alle notwendigen Verfahrensschritte ließen sich vollständig automatisieren und es wurde eine hohe Verfahrensreproduzierbarkeit erreicht. Für den Betrieb der Online-SPE werden zusätzliche Schaltventile benötigt, um die SPE-Anreicherungssäule zu konditionieren, die Substanzen aus der Probe anzureichern und im Gegenstrom auf die chromatographische Säule zu eluieren. Im Rahmen einer Verfahrensvalidierung wurden verschiedene wichtige Einflussgrößen optimiert. Dies betraf z.B. die Auswahl geeigneter SPE-Säulen für die Probenanreicherung sowie die Chromatographie-Trennsäulen. Ferner wurde das Probenvolumen sowie die Fließgeschwindigkeit für die Beladung und die Elution optimiert.

Notwendige Ventilschaltungen

Zur Verdeutlichung sind die notwendigen Ventilschaltungen in einer schematischen Übersicht (s. Abb. 1a bis d) dargestellt und nachfolgend skizziert:

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  • a) Injektion: Eine 5-mL-Probenschleife (Loop) wird mit der ggf. zuvor filtrierten Wasserprobe befüllt. Parallel erfolgt die Konditionierung der SPE-Anreicherungssäule mit dem zusätzlichen Pumpensystem (QSM).
  • b) Extraktion: Ventil V 1 wird geschaltet und die Probe wird im Anreicherungsschritt mittels des QSM über die SPE-Anreicherungssäule gefördert. Die Anreicherungsgeschwindigkeit beträgt 2 mL/min. Die Extraktion der Komponenten ist somit nach 2,5 min abgeschlossen.
  • c) Elution: Nun wird Ventil V 2 geschaltet und der BSM eluiert die extrahierten Stoffe im Backflushmodus von der SPE-Anreicherungssäule. Mit dem Elutionsfluss gelangen sie zur Auftrennung und Detektion über die Chromatographiesäule in das Massenspektrometer. Die Elution erfolgt mit dem für die Chromatographie genutzten Laufmittelgemisch.

In Tabelle 2 (laborpraxis.de) sind die chromatographischen Bedingungen zum Online-SPE-Verfahren skizziert, Abbildung 2 zeigt beispielhaft die Totalionenchromatogramme (TIC) der sechs untersuchten Hormone. Die Tabellen 4 und 5 enthalten die aus den Validierungsversuchen gewonnenen Verfahrenskenndaten. Die Ergebnisse zeigen, dass sich die untersuchten Steroide empfindlich und sehr reproduzierbar analysieren lassen. Die Matrix der untersuchten Oberflächenwässer wirkte sich im Vergleich zur Matrix weniger belasteter Wässer (Grund- und Trinkwässer) nicht signifikant nachteilig auf die Lebensdauer der Anreicherungssäule aus.

Fazit

Sowohl die schnelle Direktinjektion als auch die sensitivere Online-SPE eignen sich für die Bestimmung synthetischer und natürlicher Steroide mittels HPLC-MS/MS. Für beide Verfahren wurde die Validierung unter Einbeziehung der Standardaddition mittels dotierter Trink-, Grund und Oberflächenwässer durchgeführt. Hierbei wurde jeweils eine hohe Robustheit festgestellt.

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