Peakidentifikation in der HPLC

23.05.2007Redakteur: LP-Redaktion

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Die HPLC-Trennung ist ausgearbeitet, die Peaks sind zugeordnet, aber die quantitativen Ergebnisse scheinen zweifelhaft zu sein.??Wie sicher sind die quantitativen Aussagen und warum ist eine positive Peakindentifikation in der HPLC so schwierig???Die HPLC ist normalerweise keine Methode zur positiven Peakidentifikation, sondern lässt ausschließlich eine negative Peakidentifikation zu. Dies beschreibt aber lediglich die Tatsache, dass die entsprechende Substanz in der Probe fehlt, wenn der Peak nicht an der Stelle auftaucht, an der im Standard unter gleichen Bedingungen ein Peak vorhanden ist. Warum ist eine positive Peakidentifikation in der HPLC nun so schwierig? Zunächst einmal ist die Retentionszeit einer Substanz nicht spezifisch. Wie allgemein bekannt ist, können in einem chromatographischen System mehrere Substanzen koeluieren, vor allem, wenn sie in ihrer Struktur sehr ähnlich sind. Es kann sich z.B. um Isomere handeln oder um Substanzen, die mehrere aromatische Ringe beinhalten und sich nur um eine CH2-Gruppe in der Seitenkette unterscheiden. Sicherheit kann hier der Einsatz eines Diodenarraydetektors bringen, da hiermit das Spektrum als zusätzliches Kriterium herangezogen werden kann. Überlagert man die UV-Spektren auf der aufsteigenden Flanke, im Maximum und auf der absteigenden Flanke, so sollten sie zunächst bei einer reinen Substanz an allen Stellen des Peaks übereinstimmen. Noch mehr Sicherheit bringt der Vergleich mit einem in der Spektrenbibliothek einer DAD-Software abgespeicherten Referenzspektrums. Dieses Spektrum sollte unter den gleichen chromatographischen Bedingungen abgespeichert worden sein, die auch für die Trennung verwendet wurden, da UV-Spektren lösungsmittelabhängig sind. Man muss sich darüber im Klaren sein, dass UV-Spektren nicht sehr spezifisch sind und durchaus für verschiedene (ähnliche) Substanzen (annähernd) identisch sein können. Auch eine „Similarity“ von 0,99999 sagt noch nichts über die Identitiät aus. Bei einer mehrkernigen aromatischen Substanz mit lediglich einer unterschiedlichen CH2-Gruppe in der Seitenkette wird das UV-Spektrum identisch sein, da sich am Chromophor nichts geändert hat.??Eine eindeutige positive Peakidentifikation ist allein mit HPLC nicht möglich. Hierzu muss man sich entweder Kopplungstechniken bedienen oder offline arbeiten. Zwar bringt der Einsatz von Diodenarraydetektion Sicherheit, trotzdem muss die Trennung zusätzlich überprüft werden. Eine Verifizierung des Ergebnisses könnte beispielsweise durch eine Überprüfung in einem anderen chromatographischen System stattfinden.??Die nächste Ausgabe behandelt die Überprüfung der Peak-?reinheit.

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