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GC/MS-basierte Frühwarnsysteme

Per VOC-Messung tückische Krankheitserreger bei Pflanzen aufspüren

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Mitchel M. McCartney et al. präferierten für ihre Untersuchung eine andere Vorgehensweise. Sie berücksichtigt Veränderungen der Biochemie von Pflanzen, wenn sie z.B. von Insekten attackiert oder im Zuge abiotischer Umweltfaktoren verletzt und in Mitleidenschaft gezogen würden. Der Stress, den die Pflanzen hierbei erfahren, hat Einfluss auf den Pflanzenstoffwechsel und dessen Endprodukte. Die Wissenschaftler verweisen mit Blick auf die Fachliteratur darauf, dass die Bestimmung biogener VOCs, die lebende Organismen verströmen, auch der Krankheitsdiagnostik diente. Dies böte die Möglichkeit einer nichtinvasiven in-situ-Technik, mit der sich eine Infektion bereits detektieren ließe, noch bevor sich erste Krankheitssymptome zeigten, mutmaßen Mitchel M. McCartney et al.

Davon ausgehend, dass P. ramorum nicht nur die Pflanze befällt, sondern sich auch im Boden und im Wasser finden lässt, wählten die Wissenschaftler ein umfangreiches Versuchsdesign mit drei verschiedenen Extraktionsvorgängen auf unterschiedlichen Ebenen, um ein Maximum an Informationen aus der Messung zu gewinnen.

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Kombination verschiedener Extraktionstechniken

Für ihre Untersuchung verwendeten Mitchel M. McCartney et al. getopfte Rhododendron-Hybride Cunninghams White, ein für P. ramorum anfälliges, weltweit gehandeltes Blütengewächs. Sie untersuchten gesunde sowie mit P. ramorum geimpfte und mit inaktivierten Erregern scheingeimpfte Pflanzen. Die Extraktion der VOCs erfolgte auf unterschiedlichen Niveaus und mit verschiedenen Techniken.

Um zu erfahren, welche Emissionen die Pflanze auf natürliche Weise abgibt, wurden Ast- und Blattwerk mit einem Kunststoffbeutel aus Polytetrafluorethen (PTFE) umhüllt. Im Inneren des Beutels wurden als Extraktionsmedium drei mit Polydimethylsiloxan (PDMS) ummantelte Twister (Gerstel) fixiert. Diese Extraktionstechnik wird als Headspace-Sorptive-Extraction (HSSE) bezeichnet (s. LP-Info-Kasten).

Ergänzendes zum Thema
LP-Info: Von HSSE, SBSE und HS-SPME

Die Headspace Sorptive Extraction (HSSE), deren Funktionsprinzip der Headspace Solid Phase Micro Extraction (HS-SPME) ähnelt, basiert auf der Stir Bar Sorptive Extraction (SBSE). Bei der HSSE erfolgt die Extraktion allerdings nicht mit einer von außen beschichteten Faser, sondern es kommt die Twister-Technologie (Gerstel) zur Anwendung, die sich u. a. durch ein deutlich größeres Phasenvolumen und damit über eine weit höhere Anreicherungskapazität auszeichnet. Der Twister ist, vereinfacht gesagt, ein Rührstäbchen für Magnetrührer, das mit einer Sorptionsschicht – im vorliegenden Beispiel Polydimethylsiloxan (PDMS) – ummantelt ist und das im Dampfraum des Vials oberhalb der Probe befestigt werden kann. Nach der Extraktion erfolgt die Thermodesorption der im PDMS sorbierten Analyten in der Thermal-Desorption-Unit (Gerstel-TDU) und direkt anschließend die GC/MS-Analyse. Die TDU-GC/MS-Analyse lässt sich vollständig automatisieren.

Als zweite Technik kam die klassische SBSE zum Einsatz: Rhododendron-Blätter wurden in Stücke geschnitten und in Methanol gegeben. Anschließend wurden die Blätter entnommen und der Lösung zwei Twister-Rührstäbchen zugesetzt, die die in Methanol gelösten VOCs extrahierten. „Charakteristisch für den Twister ist sein gegenüber der SPME-Faser sehr großes Phasenvolumen, wodurch eine bis zu tausendfach größere Empfindlichkeit gegenüber der SPME resultiert“, sagt Oliver Lerch. Inzwischen stünden für die SBSE verschiedene Twister mit unterschiedlichen Phasen zur Verfügung, berichtet der promovierte Chemiker und Applikationsexperte von Gerstel, mit denen sich eine große Bandbreite unterschiedlich polarer Verbindungen höchst sensitiv extrahieren und sowohl mittels Thermodesorptions-Gaschromatographie (TD-GC/MS) als auch mittels Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC/MS) bestimmen ließen.

Schließlich und endlich wurden die Rhododendron-Gewächse gegossen, genauer gesagt, das Erdreich gewässert und auf diese Weise extrahiert. Aus dem aufgefangenen Durchfluss wurden wenige Milliliter entnommen und unmittelbar für eine Solid Phase Micro Extraction (SPME) verwendet.

Kontamination mit Schaderreger erkennbar

Sämtliche Proben aus allen Extraktionen wurden mittels Gaschromatographie und Massenspektrometrie (GC/MS) analysiert. Die Identifizierung der chromatographischen Peaks erfolgte durch Abgleich mit der NIST-Datenbank sowie dem Kovats-Retentionsindex.

Die HSSE-TDU-GC/MS-Analyse von Ast- und Blattwerk einer gesunden Pflanze brachte 79 natürlicherweise emittierte VOCs zu Tage; die SBSE-TDU-GC/MS-Analyse des Methanol-Blatt-Extraktes 115 VOCs, davon fanden sich 54 auch bei der HSSE-Analyse. Die größere, mit der SBSE erzielte Zahl, erklären sich die Forscher durch die zusätzliche physische Verletzung der Blattmatrix, die eine vermehrte Emission von VOCs verursache. Die am häufigsten mittels HSSE und SBSE gemessenen Verbindungen waren Sesquiterpene, Monoterpene, Diterpene und Terpenoide.

Anschließend wurden die Pflanzen geimpft bzw. scheingeimpft, und nach rund 130 Tagen erfolgte die HSSE respektive SBSE der VOCs. Hierbei fanden die Wissenschaftler mit beiden Methoden eine Verbindung, die in gesunden Pflanzen deutlich höher vorliegt: 3-Hexenylpentanoat. Insgesamt stellten Mitchel M. McCartney et al. fest, dass das VOC-Signal in seiner Gesamtheit bei den infizierten Pflanzen abnimmt, was die Wissenschaftler mit einer mutmaßlichen Abnahme der pflanzlichen Stoffwechselaktivität erklären. Darüber hinaus hätten sie bei den mit P. ramorum geimpften Pflanzen gehäuft die Verbindung 1-Octen-3-ol gefunden, welches seinen Ursprung vermutlich im Stoffwechsel des Erregers hat.

Die SPME des Ablaufwassers ergab bei den geimpften Pflanzen vier flüchtige Verbindungen, die nur im Boden vorkamen, der mit dem Erreger infiziert war. Hierbei handelte es sich um Rückstände ungesättigter Fettsäuren wie Hexadecensäure und Octadecensäure, die unmittelbar von den pathogenen Keimen stammen. Alles in allem, mutmaßen die Wissenschaftler, liefere die von ihnen durchgeführte Analytik einen guten Ansatz zur Entwicklung eines wirksamen Diagnosewerkzeugs, mit dem sich Phytophthora-Infektionen in Gärtnereien und Gewächshäusern frühzeitig erkennen lassen. Weitere Forschung ist angezeigt und notwendig.

Literatur:

[1] Mitchel M. McCartney et al., Effects of Phytophthora ramorum on volatile organic compound emissions of Rhododendron using gas chromatography-mass spectrometry, Analytical and Bioanalytical Chemistry 410 (2018) 1475-1487

* G. Deußing: Redaktionsbüro Guido Deußing, 41464 Neuss

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