Pipettierroboter als Fehlerquelle beim automatisierten Liquid Handling

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Typen von Pipettenspitzen und Kontamination

Die Typen von Pipettenspitzen, die der Pipettierroboter verwendet, sind entscheidend für die Richtigkeit und Präzision jedes Volumentransfers. Für Pipettierroboter, die permanente Spitzen verwenden (einschließlich Pin Tools), müssen rigorose und effektive Reinigungsroutinen eingehalten werden. Ineffizientes Waschen kann dazu führen, dass unerwünschte Reagenzienreste übertragen werden und nachfolgende Transferschritte kontaminieren. Es ist daher wichtig, dass entsprechende Validierungsprotokolle zum Nachweis der Waschschritte befolgt werden. Dies gewährleistet, dass die Spitzen rein sind und keine Probenreste zurückbleiben. Bei der Verwendung von Einwegspitzen ist der Typ der Spitze von großer Bedeutung für die Integrität des Pipettierens. Anstelle von No-Name-Massenprodukten sollten stets Spitzen von Markenherstellern verwendet werden, die der Hersteller des Liquid-Handling-Systems empfiehlt. Die Funktionstüchtigkeit der Spitze hängt nachweislich von ihrer Qualität ab; das Material, die Form und Eigenschaften, die Passgenauigkeit und Benetzbarkeit haben alle Einfluss auf die Messgenauigkeit und Wiederholbarkeit der Pipettiervorgänge. Günstigere Massenware ist oft nicht mit derselben hohen Präzision hergestellt und hat nicht selten variable Eigenschaften, die sich auf das Pipettierresultat auswirken. Beispiele hierfür sind Unterschiede im oberen Durchmesser, im Neukunststoffanteil oder auch das Vorhandensein von Kunststoffresten innerhalb der Spitze. Es kommt vor, dass Pipettierroboter für variierende Ergebnisse verantwortlich gemacht werden, die tatsächlich auf die Spitzen zurückgeführt werden können.

Kontamination kann eine weitere Fehlerquelle bei automatisierten Anlagen sein. Während der Pipettierkopf über den Tisch fährt um Reagenzien aufzunehmen und an einer anderen Position wieder abzugeben, oder Pipettenspitzen abwirft, können Tröpfchen von der Spitze auf die Arbeitsoberfläche fallen; insbesondere, wenn Reagenzien mit geringer Oberflächenspannung oder organische Lösungsmittel verwendet werden. Es ist ratsam zu überprüfen, ob Tröpfchen an den Spitzen verbleiben, wenn eine Probe abgegeben bzw. aufgenommen wurde. Manche Anwender nehmen unmittelbar nach Aufnahme des Reagenzes zusätzlich noch ein wenig Luft mit in die Spitzen, um so das Risiko, dass Flüssigkeit aus der Spitze austritt, zu minimieren. Außerdem sollte man genau planen, wann und wo Einwegspitzen abgeworfen werden, um Kontamination durch zufällige Reagenzspritzer auf der Arbeitsoberfläche zu vermeiden.

Fehlerquelle: Sequenzielle Abgabeungenauigkeiten

In manchen Pipettierprotokollen wird eine verhältnismäßig große Reagenzmenge aspiriert und anschließend sequenziell, oder systematisch, über eine Mikroplatte abgegeben. Zwar spart diese Methode Zeit, erlaubt allerdings auch Fehler, die mit variabler Genauigkeit in Verbindung gebracht werden können. Anwender müssen sicherstellen, dass die Spitzen während der Abgabe nicht mit Flüssigkeiten in den Wells in Berührung kommen, da andernfalls die Gefahr von Kontamination oder Verdünnung droht. In der Regel wird empfohlen, eine Trockenabgabe (Abgabe in ein trockenes Well) oder alternativ eine kontaktlose Abgabe oberhalb des mit einem Puffer gefüllten Wells durchzuführen. Wenn eine Methode einen sequenziellen Volumentransfer vorsieht, sollte der Anwender sicherstellen, dass in jedem Transfer dasselbe Volumen abgegeben wird. Es ist häufig zu beobachten, dass im ersten und/oder letzten Transferschritt eine leicht abweichende Menge übertragen wird.

Fehler durch das Erstellen von Verdünnungsreihen

Eine Verdünnungsreihe ist ein systematischer Testprozess, bei dem die Konzentration eines wichtigen Reagenzes sequenziell herabgesetzt wird. Die Assays werden überwiegend auf einer Mikroplatte vorgenommen, wobei die Reihen (oder Spalten) auf der Platte schrittweise geringere Konzentrationen des zu untersuchenden Reagenzes enthalten. In vielen Anwendungen einer Verdünnungsreihe wird das zu untersuchende Reagenz in eine Spalte von Wells, die eine vorbestimmte Menge eines Versuchspuffers enthalten, transferiert. Nach der Abgabe des Reagenzes werden die Komponenten in den Wells gemischt (entweder durch Auf- und Abpipettieren oder durch On-board-Schütteln), bevor ein Teil der verdünnten Probe in die nächste Spalte von Wells transferiert und dort weiter verdünnt wird.

Beim Erstellen von Verdünnungsreihen muss sichergestellt werden, dass sowohl das übertragene Probenvolumen exakt ist, als auch dass jedes Well einwandfrei durchmischt ist, bevor der nächste Transfer stattfindet. Sind die Reagenzien in den Wells vor dem Transfer nicht ausreichend durchmischt und damit nicht homogen, unterscheidet sich die Konzentration des betreffenden Reagenzes erheblich von den angenommenen, theoretischen Konzentrationen auf der Platte. Die Ergebnisse werden daher fehlerhaft sein, wobei übersehen werden kann, dass der Fehler auf ungenügende Durchmischung zurückzuführen ist.

Richtige Pipettiermethode und Methodenparameter

Ein erster Schritt zur Minimierung von Fehlern beim Gebrauch von Pipettierrobotern ist die Wahl der richtigen Pipettiermethode. Im häufig angewendeten Forward-Modus wird das gesamte, in die Spitze aufgenommene Reagenz wieder abgegeben. Der Forward-Modus eignet sich für wasserhaltige Reagenzien, die keine oder nur kleine Mengen an Proteinen oder Tensiden enthalten. Bei dem Reverse-Modus handelt es sich um eine Pipettiertechnik, bei der mehr Reagenz in der Spitze aufgenommen als anschließend wieder abgesetzt wird. Das in der Spitze verbleibende Reagenz wird entweder in ein Reagenzreservoir zurückgegeben oder entsorgt. Diese Methode eignet sich für viskose oder schäumende Flüssigkeiten.

Auch die falsche Definition von Variablen in der Software birgt die Möglichkeit für Fehler im automatisierten Liquid-Handling. So sollte der Anwender sicherstellen, dass alle Prozessvariablen (Aspirations-/Abgaberaten und -höhen, gewünschte Volumina, Pausen, Einstellungen der Flüssigkeitsklassen, etc.), die Arbeitsflächenanordnung (Position von Verbrauchsmaterialien und Geräten) und die Art der Verbrauchsmaterialien (Art und Größe der Mikroplatten, Größe der Reagenzreservoire, etc.) für jedes Assay im Test korrekt definiert sind.

Eine solche Prozessvariable ist beispielsweise die Eintauchtiefe der Spitze in das Reagenz während des Aspirierens, die etwa 2 bis 3 mm betragen sollte. Wird ein Reagenz kontinuierlich aus einem Reservoir entnommen, ohne dass die Spitzenhöhe entsprechend angepasst wird, können Pipettierfehler auftreten. Eine Möglichkeit zur Vermeidung dieses Fehlers ist die Verwendung von leitenden Spitzen zur Identifizierung der Flüssigkeitsoberfläche. Diese Spitzen können allerdings Fehler herbeiführen, wenn sie für schaumige Reagenzien verwendet werden und das System dann fälschlicherweise das Vorhandensein von Flüssigkeit unterstellt.

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