BIO- GENTECHNOLOGIE Pluridimensionale Kapillar-HPLC und Elektrophorese

Eine überaus vielversprechende Alternative zur Elektrophorese ist pluridimensionale Kapilar-HPLC

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Für Analysen eines Proteoms ist Elektrophorese noch immer die Methode der Wahl. Gravierende Nachteile sind allerdings der hohe Zeit- und Arbeitsaufwand sowie die Tatsache, dass die Proteine bei 2D-Elektrophoresen denaturiert werden. Eine überaus vielversprechende Alternative ist pluridimensionale Kapilar-HPLC: Sie ist schneller, hat niedrigere Nachweisgrenzen und erhält die biologische Aktivität der analysierten Proteine.

Unter dem Begriff Proteom versteht man heute üblicherweise die Gesamtheit aller Proteine, die von dem Genom einer Zelle oder eines Organismus unter genau definierten Bedingungen zu einem bestimmten Zeitpunkt exprimiert werden. Neben der Vielzahl der exprimierten Proteine einer lebenden Zelle bereiten bei der Analyse die Löslichkeit dieser Makromoleküle sowie der Erhalt ihrer biologischen Aktivität weitere Schwierigkeiten.

Die am häufigsten angewandte Technik solch komplexe Proben zu analysieren ist wegen ihrer hohen Auflösung noch immer die zweidimensionale Gelelektrophorese. Bei ihr werden die Proteine in der ersten Dimension durch Isoelektrofokussierung entsprechend ihrem isoelektrischen Punkt bzw. ihrer Ladung und in der zweiten Dimension durch SDS-Elektrophorese entsprechend ihrer Größe bzw. ihrem Molekulargewicht in einem Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) getrennt. Nach Anfärben mit Coomassie-Blau, Silver-Staining oder nach tryptischem Abbau und Massenspektrometrie, z.B. durch Maldi-TOF oder LC/ESI-QIT, können auf solch einem 2D-Gel über 1500 Proteine nachgewiesen werden.

Native Enzyme: Fehlanzeige

Der wohl gravierendste Nachteil dieser Methode, neben dem hohen Arbeitsaufwand und der oft nur dürftigen Reproduzierbarkeit, ist der Umstand, dass u.a. auf Grund der denaturierenden Bedingungen der SDS-Gelelektrophorese keine nativen Enzyme identifiziert werden können, somit also Untersuchungen der biologischen Aktivität einzelner Proteine oft nicht zugänglich sind. Wegen dieser Schwierigkeiten, und nachdem gezeigt werden konnte, dass z.B. durch sterische Ausschlusschromatographie (SEC) die mit Kapillar-HPLC-Säulen zu erzielende Empfindlichkeit bis zu 100-mal höher ist als die von mit Silver-Staining angefärbten SDS-Polyacrylamidgelen, wird nun eine Strategie vorgeschlagen, die es ermöglicht, durch Kapillar-HPLC geringste, derzeit elektrophoretisch nicht mehr nachweisbare Mengen biologisch aktiver, d.h. nativer Enzyme zu isolieren.

Diese Strategie besteht aus einer intelligenten Kombination chromatographischer Techniken, die im Folgenden zusammen mit den entsprechenden experimentellen Ergebnissen beschrieben wird. Erklärtes Ziel war es, eine Methode zu entwickeln, die es erlaubt, in möglichst kurzer Zeit, ohne großen Arbeitsaufwand und hochempfindlich, Proteine in ihrer nativen Form zu analysieren und isolieren. Diese Technik sollte nicht als Konkurrenzmethode zur 2D-Elektrophorese betrachtet werden, sondern vielmehr als Ergänzung. Es galt daher, die bewährten, schnellen und biokompatiblen HPLC-Techniken der sterischen Ausschluss-, der Ionenaustausch- und der hydrophoben Interaktionschromatographie so miteinander zu einer Kaskade zu kombinieren, dass die oft für die Isolierung von Proteinen notwendigen Zwischenschritte wie Dialyse und Aufkonzentrieren vermieden werden können.

Denn nur durch intelligente Kombination mehrerer chromatographischer Schritte ist die Auflösung der 2D-Elektrophorese von über 1000 Proteinen zu erreichen. Ferner war und ist beabsichtigt diese pluri-dimensionale HPLC zu automatisieren. Da nur durch Kapillar- und Nano-HPLC die für die Analyse von Proteomen notwendige und mit 2D-Elektrophoresen vergleichbare bzw. diese sogar übertreffende Empfindlichkeit erzielt werden kann, wurden sämtliche verwendeten Säulenmaterialien „aus einer Hand“ (siehe Kasten) bezogen, zumal diese auch die für das Packen dieser „Säulchen“ notwendige mechanische Stabilität besitzen.

Die gewählte Strategie bestand also darin, die zu analysierende Probe, Körperflüssigkeit oder Bakteriensuspension, durch Filtration, Zentrifugation, Zellaufschluss und Salzfällung so vorzubereiten, dass sie auf eine SEC-Säule (TSKgel 4000 SWXL) aufgetragen werden konnte. Dies ermöglichte eine Anreicherung der Proteine nach ihrer Größe. Gleichzeitig wurde die Probe so konditioniert, nämlich nach Ionenstärke und pH-Wert „umgesalzen“, dass das Eluat genau den Bedingungen entsprach, die für die als zweiten Trennschritt gewählte Anionenaustauschchromatographie (TSK Bioassist Q) notwendig waren.

Leider war trotz Elution durch Salzgradient die Ionenstärke des Eluates der Ionenaustauschsäule nicht hoch genug, so dass dieses für den dritten Reinigungsschritt, nämlich hydrophobe Interaktionschromatographie (TSK Phenyl 5PW), vor der Injektion auf diese Säule durch eine kurze Vorsäule (TSKgel SuperSW guard column) auf 2 M Ammoniumsulfat erneut umgesalzt werden musste. Im vorliegenden Beispiel konnte das zu analysierende Protein durch Kombination dieser drei Schritte erfolgreich isoliert werden.

ß-Galaktosidase als Testprotein

Um zu zeigen, dass durch pluridimensionale Kapillar-HPLC native Enzyme aus Proteomen mit hoher Empfindlichkeit analysiert werden können, war als Testsubstanz, das Enzym ß-Galaktosidase aus Escheria Coli K12 gewählt worden (s. Abb. 1). Dieses bekannte Enzym (MW 480000) besteht aus vier Untereinheiten (MW jeweils ~120000) und spaltet als natürliches Substrat Lactose in Glucose und Galactose. Da die Kapillar- und Nano-HPLC sogar wesentlich empfindlicher ist als das Silver-Staining von Polyamidelektrophoresengelen, mussten zur Isolierung der ß-Galaktosidase die chromatographischen Schritte zunächst auf analytischen Säulen (4,6 - 7,5 mm ID) ausgearbeitet werden.

Hierbei wurden im Eluat jedes einzelnen Schrittes die Fraktionen auf Enzymaktivität getestet und die Anreicherung des Enzyms u.a. elektrophoretisch kontrolliert (s. Abb. 3). Nur die „aktiven“ Fraktionen wurden dann vereinigt und auf die nächste Säule injiziert. Da ein HPLC-Trennungsschritt in weniger als 30 Minuten durchgeführt werden kann, man jedoch für normale SDS-PAG-Elektrophoresen und die Anfärbung der Gele bis zu 24 Stunden benötigt, wurden die eluierten Fraktionen durch SDS-Elektrophoresen auf 15 x 15 mm großen Chips kontrolliert. Mit diesem Lab-on-a-Chip konnten bis zu sechs Proben bearbeitet werden, was mit weniger Arbeitsaufwand verbunden und außerdem vom Auftragen bis zum Anfärben in nur zwei Stunden erledigt war.

Nach der Überprüfung mit einer konventionellen SDS-PAGE-Elektrophorese konnten die chromatographischen Bedingungen auf Kapillarsäulen übertragen werden (Abb. 2 u. 4). Aufgrund der Tatsache, dass Proben durch sterische Ausschlusschromatographie stark verdünnt werden, durch Ionenaustausch- und hydrophobe Interaktionschromatographie mit Gradienten-Elution hingegen konzentriert werden können, mussten die Dimensionen der Kapillarsäulen für diese Kaskade einander angepasst werden. Da- her wurden für die SEC Säulen mit 300 mm x 800 µm, für die IEC 75 mm x 300 µm, für das Resalting 30 x 2 mm, sowie die HIC 100 mm x 300 µm verwendet. Wie erwartet konnte diese Kaskade pluridimensionaler Kapillar-HPLC nur noch durch entsprechende Aktivitätstests überprüft werden.

Zusammenfassung: Die Verwendung moderner HPLC Säulen bzw. der Einsatz neuer Packungsmaterialien ermöglichten die Isolierung des Enzyms ß-Galactosidase in nativer, aktiver Form in nur 4 bis 5 Stunden. Früher brauchte man für dessen Reinigung unabhängig vom Durchmesser der verwendeten Chromatographiesäulen mehrere Tage, z.T. sogar bis zu einer Woche

Ausblick

Als nächstes Ziel bleibt nun noch statt nach jedem Schritt auf herkömmliche Art und Weise mit einem Fraktionensammler „offline“ das Eluat zu fraktionieren, ein Multiport-Ventil für die Kapillar-HPLC mit geringsten Totvolumina zu entwickeln und so die beschriebene chromatographische Kaskade durch „Peak Parking“ voll zu automatisieren. Diese Technik stünde dann auch für die Analyse anderer Biopolymere wie DNA/RNA [18] zur Verfügung und wäre bei der Analyse von Proteinen der 2D-Elektrophorese nicht nur in ihrer Trenneffizienz vergleichbar und zumindest ebenbürtig.

BEZUGSQUELLEN

Materialien und Instrumente

Die für die HPLC verwendeten Puffersubstanzen und Lösungsmittel wurden von Merck bezogen. Die für das Resalting, für die SEC, IEC und HIC verwendeten konventionellen, analytischen Säulen (4,6 bzw. 7,5 mm ID) wurden ebenso wie die entsprechenden Kapillar-HPLC-Säulen (800 bzw. 300 µm ID) von Tosoh Bioscience zur Verfügung gestellt. Die mikropräparative chromatographische Kaskade wurde mit einem Äkta-Basic HPLC-System von Amersham Biosciences durchgeführt, die Trennungen auf den Kapillar Säulen mit einem Kapillar-HPLC-System der Firma Sunchrom.

Sämtliche Chemikalien, die für die Kontrolle der chromatographischen Schritte durch SDS-PAGE eingesetzt wurden, wurden von den Firmen Bio-Rad Laboratories, Merck und Serva erworben. Zunächst wurden wegen der geforderten Empfindlichkeit die Elektrophoresen (Sammelgel 4 %, Trenngel 10 % Acrylamid) in einer Mini Protean II-Kammer (Gele: 8 x 6 x 1,5 cm) von Bio-Rad mit 40 – 5 mA zum Konzentrieren bzw. mit 70 – 90 mA während der Trennung selbst durchgeführt und anschließend durch Silver- Staining angefärbt. Für die Auswertung stand ein Gel-Scanner GS-800 von Bio-Rad zur Verfügung. Später jedoch wurde diese Technik durch Elektrophoresen auf 1,5 x 1,5 cm großen Chips mit dem Experion System, ebenfalls von Bio-Rad, ersetzt.

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