Vier Buchstaben, fast endlose Möglichkeiten: Die HPLC ist als Analysemethode im Labor von unschätzbarem Wert und wird in diversen Varianten täglich eingesetzt, um Produkte zu prüfen, neue Formulierungen zu entwickeln und Substanzgemische zu analysieren. Beim Praxistag HPLC treffen sich einmal im Jahr Anwender und Experten, um gemeinsam über die Hochleistungsflüssigchromatographie zu diskutieren, so auch am 6. und 7. November in Berlin zum insgesamt 13. Praxistag HPLC. Mit einem vielfältigen Programm aus 14 Fachvorträgen lernten die rund 70 Teilnehmer hier Neues zu Methodenentwicklung, Laborsicherheit, Nachhaltigkeit und vor allem auch dem Troubleshooting in der HPLC.

Was die zweitägige Fortbildung zu bieten hatte, lesen Sie in diesem Veranstaltungsrückblick.

Werksführung bei Knauer

Als Auftakt zum Praxistag hatten 30 der Teilnehmer die Gelegenheit, eine Werksführung bei Knauer zu erleben.

Am Produktionsstandort in Berlin durften die Gäste hinter die Kulissen des Experten für Chromatographie blicken: Zum einen in die Produktion des Unternehmens, wo Bauteile sowie vollständige Geräte hergestellt werden. Dabei findet der Großteil der Arbeit vor Ort statt und nur wenige Materialien werden zugekauft.

Zum anderen besichtigten die Teilnehmer die hauseigenen Forschungslabore, in denen Methodenentwicklung und Produktoptimierung stattfinden. Nach der insgesamt rund 90-minütigen Werksführung ging es direkt weiter zum Praxistag HPLC.

1) Den pH-Wert richtig nutzen

Als Auftakt stellte Prof. Dr. Thomas Welsch in seiner Keynote vor, welchen Einfluss der pH-Wert auf die Trennleistung einer Umkehrphasen-Chromatographie hat (RPC, Reversed Phase Chromatography). Der passionierte Chromatographie-Experte und ehemalige Leiter des Instituts für Analytische Chemie und Umweltchemie an der Universität Ulm rief den Teilnehmern wichtige Kenngrößen aus Unizeiten ins Gedächtnis zurück und ermutigte dazu, sich wieder intensiver mit der Natur der verwendeten Trennsäulen auseinanderzusetzen. Oft wisse man gar nicht mehr, mit welchen Substanzen man arbeite, gab Welsch zu denken: „Die Phasen haben heute meistens irgendwelche Mondscheinnamen, die gar nichts mehr über ihre Chemie aussagen.“ Der chemische Aufbau der Säulenpackung sei aber wichtig, um zu verstehen, wie die Trennung funktioniert und welche Säule am besten für das jeweilige Aufgabengebiet geeignet ist.

Für die RP-Chromatographie spielt laut Welsch der pH-Wert eine besonders wichtige Rolle. Ist er falsch eingestellt, kann es passieren, dass sich die Säulenpackung im schlimmsten Fall schlicht auflöst. Grundsätzlich sei zu beachten, dass Restsilanolgruppen der stationären Phase je nach pH-Wert neutral oder ionisiert sein können. Negative Silanolgruppen hindern negativ geladene Analyten daran, in die Poren der stationären Phase einzudringen. Es folgt ein unsymmetrischer Massentransfer, der sich in Haiflossen-artigen Peaks im Chromatogramm äußert, wie Welsch in seinem Vortrag zeigte.

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2) Non-Target-Screening mittels SFC

Welchen Stellenwert die Chromatographie mit superkritischen Fluiden (SFC, Superkritische Fluid Chromatographie) in der Analytik einnimmt, präsentierte Dr. Thomas Letzel vom Analytischen Forschungsinstitut für Non-Target Screening AFIN. Er stellte die Methode als sinnvolle und leistungsstarke Alternative im Bereich des Non-Target Screenings vor. Sein Anliegen: Die SFC als typisches „Angstthema“ aus dem universitären Kontext zu entschärfen und greifbarer zu machen. So betonte er, dass es in der Analytik organischer Moleküle keine Good Guys und Bad Guys gebe – man messe schlicht geladene Moleküle und brauche dafür die passende Trennmethode. Gerade die SFC besitze hier einige Eigenschaften, die sie für das Screening nach sehr polaren Verbindungen interessant erscheinen lässt. So seien SFC-Trennungen mitunter deutlich schneller und effizienter als klassische LC-Trennungen, wie Letzel anhand von Retentionszeit-Vergleichen zeigte. Durch die Verwendung geeigneter stationärer Phasen könne die SFC ein sehr großes Spektrum von organischen Verbindungen trennen, welches dem von Umkehrphasenchromatographie (RPC) und Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) entspricht.

3) Wie wird meine HPLC grüner?

Nachhaltigkeit ist ein übergreifendes Thema, welches auch im Labor zunehmend an Bedeutung gewinnt. Doch welche Stellschrauben bietet die HPLC, um ökologischer zu werden? Dieser Frage ging Dr. Frank Michel, Sustainability & Training Specialist bei Merck, nach. Seine Botschaft: „Lösemittel sind der größte Hebel für eine nachhaltigere HPLC.“ Dies untermauerte er mit dem Vergleich von klassischen erdölbasierten Lösemitteln und solchen, die auf Basis von nachwachsenden Rohstoffen hergestellt werden. So hat etwa fossiles Ethanol einen sechsmal größeren CO2-Fußabdruck als Ethanol in der biobasierten Form.

Auch die Säulendimensionen sind ein Ansatzpunkt für mehr Nachhaltigkeit. HPLC-Säulen mit kleinerem Innendurchmesser (ID) benötigen weniger Lösungsmittel, erzeugen damit weniger Abfall und senken letztlich die Kosten für Lösemittel. So könne der Wechsel von einer 4,6 mm ID- zu einer 2,1 mm ID-Säule bis zu 80 % der mobilen Phase einsparen.

Derartige Änderungen an etablierten Workflows sind allerdings nicht immer einfach umzusetzen. Gerade im stark regulierten Pharmabereich stößt man schnell an Grenzen. Michel ist jedoch überzeugt, dass es auch dort oft eher eine Grundeinstellung ist, weniger eine Vorschrift, die dem „Green Change“ entgegensteht.

4) Nachhaltig und produktiv dank Miniaturisierung

Auch im Vortrag von Dr. Aline Bayerle von Agilent drehte sich alles um Wege, die HPLC nachhaltiger zu gestalten. Sie setzte den Fokus auf den von ihrem Vorredner bereits angesprochenen Innendurchmesser der Säule und die Miniaturisierung bestehender HPLC-Methoden – selbst im Pharmaumfeld. „Der Innendurchmesser ist einer der wenigen Parameter, der nicht reguliert wird durch die USP 621. Man kann also auch Innendurchmesser von 1 mm verwenden“, sagte die Expertin. Zudem erlaube die USP 621 mittlerweile, bis zu 20 Prozent kleinere Partikel innerhalb der Methode zu verwenden, sodass eine Anpassung vergleichsweise einfach umzusetzen sei.

Auch der Einsatz von Core-Shell-Partikeln könne sich positiv auf die Trennung auswirken. „Gerade bei der Trennung von großen Biomolekülen ist es wirklich vorteilhaft, Superficially Porous Particles zu verwenden“, empfahl Bayerle.

5) Achtung: leerlaufende Eluenten!

Was ist eines der unnötigsten Ärgernisse in der HPLC? Laut Martin Alt ist das wohl das Leerlaufen des Eluenten während einer chromatographischen Trennung. Vor allem bei Über-Nacht-Läufen kann dieser Fehler vergleichsweise leicht passieren. „Statistisch fallen jede Woche 15 von 100 HPLC-Systemen aufgrund von Eluentenleerlauf aus“, sagte der Referent der Firma Quacx in seinem Vortrag. Das kostet die Anwender Zeit für den Reset, und damit Geld. In einer Beispielrechnung kam Alt auf ein Einsparpotenzial von rund 15.000 Euro pro Jahr für ein Labor mit zehn HPLC-Instrumenten – und dabei waren nur die Lohnkosten für den Mitarbeiter berücksichtigt (210 Euro pro „Laborstunde“), die Kosten für Verbrauchsmaterial sowie Aufarbeitung nicht vermessener Proben waren noch nicht inkludiert.

Um das zu verhindern, bietet sich eine automatisierte Eluentenüberwachung an. Dazu hat Quacx ein Wägesystem sowie ein Radarsystem für Eluentenflaschen und Lösemittelabfälle entwickelt, mit dem die Füllstände jederzeit überwacht werden. Was sich zudem aus den elektronischen Daten im Labor gewinnen lässt, zeigten später Alts Kollegen in einem eigenen Vortrag.

6) Sensibilisiert für Sicherheit

Auch wenn das Thema vielen Anwendern im Labor zu den Ohren heraushängt, sind Sicherheitsunterweisungen doch enorm wichtig für jeden Betrieb, in dem HPLC betrieben und damit mit gefährlichen Lösemitteln und Chemikalien gearbeitet wird. Im Vortrag von Dr. Maximillian Heidrich, Projektmanager bei Scat, gab dieser daher sozusagen eine Sicherheitsunterweisung light und führte die Teilnehmer des Praxistages HPLC durch typische Situationen im Labor, an denen es für die Anwender gefährlich werden kann. Plakativ stellte er das Bild eines Autolackierers mit Atemmaske dem einer Laborantin am Lösemittelvorrat einer HPLC-Anlage gegenüber und stellte die Frage: „Warum wird die Laborantin nicht geschützt?“ Auch, wenn Lösemitteldämpfe im Labor im Idealfall niedrig konzentriert und durch Abzüge von den Anwendern entfernt gehalten werden, stellen diese Dämpfe eine Gefährdung dar. Heidrich sensibilisierte zu Aspekten wie Aufnahmewegen und Arbeitsplatzgrenzwerten und zeigte Möglichkeiten auf, wie Lösemittel im HPLC-Labor sicher gelagert und entsorgt werden können.

7) Hinter den Kulissen der Kunststoffproduktion

Einen Exkurs der besonderen Art lieferte Dominik Werner von Bohlender in seinem Vortrag. Er führte die Teilnehmer auf eine virtuelle Werksbesichtigung am Produktionsstandort in Grünsfeld und erklärte anschaulich, wie dort Tag für Tag Werkstücke aus Hochleistungskunststoff gefertigt werden, etwa für Anwendungen in HPLC-Systemen. „PTFE ist der große Liebling im Labor. Das ist ein Kunststoff, der nicht den Namen Plastik verdient“, meint Werner. „Das ist ein richtiger Hochleistungskunststoff.“

Im Anschluss diskutierte Werner noch das aktuelle Problem der PFAS-Chemikalien, welches auch die Hochleistungskunststoffe für die HPLC betrifft. Hier sieht der Experte noch einige Herausforderungen zu bewältigen, nicht zuletzt aufgrund lange etablierter Workflows und Vorschriften in der Branche.

8) Vom Säulenleben und -sterben

Praxistipps für ein längeres Leben hatte Dr. Kevin Brahm von YMC Europe mit dabei. Er erklärte in seinem Vortrag, was der Lebensdauer von Trennsäulen schadet, und wie man sie entsprechend gut behandelt, um sie lange und zuverlässig nutzen zu können. „Bei pH-Werten unter 2 stirbt eine Silica-Säule recht schnell“, gab Brahm als Faustregel. Und neben chemischen sind auch physikalische Belastungen zu vermeiden. „Plötzliche Druckpulse sind der Tod für Säulen.“ Mechanischer Stress könne sich in Basislinienrauschen und Peakverbreiterung niederschlagen, bis hin zum Verlust der Auflösung, erklärte der Experte. Anhand mehrere Fallbeispiele illustrierte er, wie verschiedenste Anwendungsfehler zu Problemen bei der chromatographischen Trennung führen – und wie sich die Ursachen finden und beheben lassen. Ein häufiger Grund für schlecht aufgelöste Peaks ist laut Brahm Überladung. Dazu zählt einerseits die Konzentrationsüberladung (zu viel Analyt in der Probe) und andererseits die Volumenüberladung, also ein zu hohes Injektionsvolumen. Als Fazit zog Brahm, dass die Ursachen der Probleme in über 90 Prozent der Fälle bekannt sind und schnell behoben werden können. Es lohne sich also der Austausch mit den Herstellern, um Fehler schnell aufzudecken und in persönlicher Beratung zu lösen.

9) Analytik von Lipidnanopartikeln

Einen Bericht aus der angewandten Bio- und Pharmaforschung steuerte Dr. Mareike Prüfer von Knauer bei. Sie forscht an so genannten Lipid-Nanopartikeln (LNPs), die als Trägerkapseln von mRNA-Impfstoffen – wie die zur Corona-Impfung genutzten – eine wortwörtlich tragende Rolle gespielt haben. LNPs sind auch weiterhin prägend im Bereich der Impfstoffentwicklung. Prüfer stellte in ihrem Vortrag die Entwicklung einer HPLC-Methode vor, die für die Qualitätskontrolle der hergestellten LNPs geeignet ist. Dazu wurde eine HPLC-Methode mit einem Lichtstreudetektor (Evaporative Light Scattering Detector, ELSD) gekoppelt und mit einem HPLC-MS-System verglichen. Prüfer zeigte die Schritte der Methodenentwicklung auf und ging auf Hürden im Prozess ein. So war etwa mit Acetonotril als Lösemittel keine ordentliche Peakform zu erzielen, während Ethanol die Proben nicht vollständig zu trennen vermochte. Die Lösung: „Wir mischen die Eluenten einfach“, erklärte Prüfer. So gelang eine gut aufgelöste Trennung der Analyten und die Methodenentwicklung konnte erfolgreich abgeschlossen werden.

10) Daten nutzen heißt, vor Fehlern schützen

In Teamarbeit stellten Dr. Thomas Hille und Dr. Julian Ramcke vor, welche Bedeutung den Dokumentationspflichten zufällt und wie leicht – gerade im pharmaregulierten Bereich – eine Ordnungswidrigkeit bei nachlässiger Dokumentation passiert. Im ersten Teil des Vortrags zeigte Pharma Consultant Hille gesetzliche Dokumentationspflichten auf, etwa nach dem strengen Betäubungsmittelgesetz (BtMG), und welche strafrechtlichen Folgen bei Missachtung drohen. Schon die Etikettierung der Substanzen findet oft zu nachlässig statt und sei im Zweifelsfall ein Beanstandungsgrund. „Wenn der Auditor gut gelaunt ist, müssen Sie nur um Etikettieren. Wenn er schlecht gelaunt ist, wird es teuer“, warnte Hille.

Im zweiten Teil präsentierte Ramcke Automatisierungsmöglichkeiten für die Probenvorbereitung und das Substanzmanagement. „Manuelle Übertragung kostet sehr viel Zeit und damit Geld. Im Pharmabetrieb wo das 4- bis 6-Augenprinz gilt, geht bei der Kontrolle sogar noch mehr Zeit verloren“ machte der Referent deutlich. Eine EDV-basierte Lösung schaffe hier Sicherheit und spare Zeit. Quacx bietet dazu ein System, das Laborgeräte und Software verknüpft, Übertragungsfehler reduziert und Arbeitsprozesse optimiert.

11) Problemlösung für die HPLC

Das Thema Troubleshooting wurde nicht nur einmal behandelt. Auch der Vortrag von Dr. Felix Feistel, Field Application Specialist LC bei Shimadzu, widmete sich den alltäglichen Problemen im Chromatographiebetrieb. Seine goldene Regel: „Legen Sie sich eine Beschreibung des Problems zurecht. Was haben Sie gemacht? Was ist dabei rausgekommen? Was ist anders als sonst? Diese Struktur hilft Ihnen und uns ungemein bei der Fehlersuche.“ Denn zu oft habe er schon erlebt, dass ein Kunde ihn anruft und auf die Worte „Meine Daten sind schlecht“ eine Lösung erwartet.

In seinem Vortrag ging Feistel u. a. auf Basisliniendrift und Geisterpeaks ein. Letztere kämen typischerweise durch Kontaminationen im System, etwa im Eluenten oder im Probenlösemittel. Auch Analyten mit starker Retention könnten sich noch aus vorherigen Trennungen auf der Säule befinden und als Geisterpeaks in einer späteren Trennung eluieren.

Mit zahlreichen Beispielen erläuterte Feistel typische HPLC-Probleme und deren mögliche Ursachen sowie Lösungen, teils mit Anekdoten aus seiner Beratungstätigkeit. So erzählte er von einem Fall, bei dem der Kunde immer mittwochs Detektionsprobleme im HPLC-System beklagte. Im Gespräch stellte sich heraus, dass mittwochs im selben Labor Proben mittels Atomabsorptionsspektrometrie gemessen wurden. Durch die Wärmeentwicklung des Ofens wurde der benachbarte Detektor der HPLC-Anlage beeinflusst, was zu den Störungen führte. Dies zeigt, dass eine umfassende Beschreibung wichtig ist, um die Ursache eines Problems zu finden.

12) Grundlagen der Methodenentwicklung

Aller Anfang ist schwer, dies trifft auch auf die Methodenentwicklung in der HPLC zu. Wie diese trotzdem gut und schnell gelingt, behandelte Stefan Steidl, Portfoliomanager LCMS bei Avantor, in seinem Vortrag. „Im Alltag kann sich selten jemand Vollzeit um die Methodenentwicklung kümmern. Da dauert es manuell auch schon Mal zwei Monate, bis eine neue Methode fertiggestellt ist“, stellte der Referent klar. Er verdeutlichte anhand eines realen Applikationsbeispiels, welche entscheidenden Fragen man sich stellen sollte. Von der Gerätekonfiguration über die Auswahl der Trennsäule bis zum Einstellen der Parameter gebe es einiges zu beachten. „Egal von welchem Hersteller Sie eine Anlage haben: Reden Sie mit den Herstellern und fragen Sie, welche Methoden mit den Geräten Sinn ergeben und für welche Methoden sie nicht geeignet sind. Das hilft, unnötige Investitionen zu vermeiden.“

13) Design Space für Chromatographie

Zum Abschluss des Praxistages stellten Dr. Markus Molnár und Dr. Hans-Jürgen Rieger vom Molnár-Institute for Applied Chromatography die Software Drylab vor. Damit ist es möglich, neue HPLC-Methoden auf wissenschaftlicher Basis anhand weniger Messungen zu entwickeln. Ausgehend von einem Dutzend Messungen erstellt die Software einen Modellraum, indem die Methode nach Wünschen der Anwender optimiert werden kann. „Den Soft Spot herauszufinden, an dem eine HPLC-Trennung ideal funktioniert, geht nur, indem man sie modelliert“, fasste Molnár zusammen.

Sein Kollege Rieger zeigte, wie sich mit der Software die verschiedenen Parameter für eine HPLC-Methode anpassen lassen, um die bestmöglichen Chromatogramme zu generieren.

14) Ausblick

Viel Input für nur zwei Tage. Der Praxistag HPLC zeigte wieder einmal, wie abwechslungsreich die Chromatographie sein kann. Von den klassischen Analytik-Trainings über Troubleshooting und Methodenentwicklung bis hin zu übergreifenden Themen wie Automatisierung, Nachhaltigkeit und sicherem Arbeiten hat das Programm beim insgesamt 13. Praxistag HPLC die große Bandbreite bespielt. Auch im kommenden Jahr wird es wieder ein volles Programm geben. Interessierte sollten sich deshalb schon einmal den 5. und 6. November 2025 vormerken. Details zum Programm und dem Veranstaltungsort werden im Laufe des nächsten Jahres bekannt gegeben. Melden Sie sich gleich für das kostenlose Eventupdate an, um keine Infos zu verpassen.

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