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Reinstwasser

Quantitative Endotoxinbestimmung von Reinstwasser

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Reinstwasser herstellen

Das System Arium pro VF (s. Abb. 1) wurde für die Herstellung von Reinstwasser aus vorbehandeltem Trinkwasser konzipiert und entfernt aus diesem noch vorhandene Verunreinigungen. Die Reinstwasserproduktion erfordert kontinuierliche Rezirkulation und einen konstanten Wasserfluss, was durch ein Pumpensystem mit Druckregelung erreicht wird. Die Leitfähigkeit des Wassers wird am Speisewasser-Einlass und beim Produktwasser (Wasser-Auslass) gemessen. Das bei den hier dargestellten Untersuchungen verwendete System Arium pro VF arbeitet mit zwei unterschiedlichen Kartuschen. Diese sind mit einem speziellen Aktivkohle-Adsorber und Mischbett-Ionenaustauscherharzen gefüllt, um hochreines Wasser mit einem geringen TOC- Gehalt zu liefern. Weiterhin verfügt das Gerät über eine integrierte UV-Lampe, die bei den Wellenlängen 185 nm und 254 nm keimtötend und oxidierend wirkt.

Bei dem Arium-Reinstwassersystem ist außerdem ein Ultrafilter-Modul eingebaut, das als Crossflow-Filter eingesetzt wird. Die verwendete Ultrafiltermembran hält Kolloide, Mikroorganismen, Endotoxine, RNA und DNA zurück. Ein am Wasserauslass installierter 0,2 µm-Endfilter dient der Entfernung von Partikeln und Bakterien aus dem erzeugten Reinstwasser während der Dosierung. Der Prozess der gerätspezifischen Wasserreinigung, ist in Abbildung 2 (Flussdiagramm Arium pro VF) dargestellt. Bei den durchgeführten Versuchen zur Bestimmung von Endotoxinen in Arium pro VF-Reinstwasser wurde sowohl mit der Gel-clot-Methode, als auch mit der chromogenen Methode gearbeitet.

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  • Gel-clot-Methode: Das lyophilisierte Lysat (Charles River Endosafe R 15006) wurde in Reinstwasser des Systems Arium pro VF gelöst und portioniert in pyrogenfreien Röhrchen eingefroren. Eine Endotoxinstandardreihe aus LPS E. coli 055:B5 (Lonza N 185) wurde in Reinstwasser des Systems Arium pro VF in den Konzentrationen von 0,001 EU/ml bis 25 EU/ml angesetzt. Das gelöste Lysat wurde mittels des angesetzten Endotoxinstandards auf die angegebene Empfindlichkeit (0,06  EU/ml) überprüft. Zu 100 µl Lysat wurden 100 µl Probe zupipettiert und bei 37 °C im Wasserbad inkubiert. Nach einer Stunde wurde jedes Röhrchen einzeln aus dem Wasserbad entnommen, um 180° gedreht und die Gel-clot-Bildung beurteilt.
  • Chromogene Methode: Das chromogene Substrat (Charles River Endochrome K R1710K) wurde in Reinstwasser des Systems Arium pro VF gelöst. Dieses chromogene Substrat und Endotoxinstandardproben wurden in endotoxinfreien 96-well-Platten im Verhältnis 1:1 pipettiert. Über die Dauer einer Stunde wurde im Minu­tentakt die Absorption jeder Probe bei 405 nm in einem Plattenreader Tecan Safire bei 37 °C gemessen.

Ergebnisse

Die Gel-clot-Methode zeigte im Bereich von 0,001 EU/ml bis 0,05 EU/ml ein negatives Ergebnis, also keine Gel-clot-Bildung (d.h. kein Nachweis von Endotoxinen, siehe Tabelle 1). Eine Konzentration von ≥ 0,1 EU/ml führte zu einer Gel-clot-Bildung. Dieses Ergebnis zeigt, dass im Arium pro VF-Reinstwasser im Rahmen der Nachweisempfindlichkeit der Gel-clot-Methode keine Endotoxine vorhanden waren. Bei der Aufnahme der 60 Absorptionsmesswerte bei 405 nm (s. Abb. 3) im Rahmen der chromogenen Methode ergeben sich je nach Endotoxingehalt der Standard-Proben unterschiedlich verlaufende Kurven. Die Zeiten, die bis zum Erreichen einer bestimmten Absorption benötigt werden, werden mit einem speziellen Computerprogramm ermittelt und für die Berechnung der Proben mit unbekanntem Endotoxingehalt zu Grunde gelegt. Da die Standardproben mit den geringsten Konzentrationen (0,005 und 0,001 EU/ml), sowie das Ariumwasser den für die Berechnung zugrunde liegenden Extinktionswert von 1 nicht erreichten, wurden sie als unterhalb der Nachweisgrenze liegend bewertet. Die aufgenommenen Messwerte für Arium pro VF-Reinstwasser lagen deutlich unter der Kurve von 0,001 EU/ml. Der Gehalt an Endotoxinen verschiedener Wasserproben (s. Abb. 4) wurde aus den Messwerten der Endotoxinstandards errechnet. In der VE-Wasserprobe wurden Endotoxine von 0,02 EU/ml nachgewiesen, was unterhalb des z.B. gültigen Grenzwertes für WFI (water for injections) ist. Im Leitungswasser wurde mit 25 EU/ml eine sehr hohe Endotoxinbelastung festgestellt. Dieser Befund wurde nicht weiter analysiert. Dagegen wurde im Reinstwasser aus dem System Arium pro VF ein mit <0,001  EU/ml sehr niedriger Wert gemessen, der weit unterhalb gängiger Grenzwerte liegt.

Diskussion

Die Ergebnisse zeigen, dass das vom Arium pro VF produzierte Reinstwasser problemlos und als preiswerte Alternative für die Probenvorbereitung im Rahmen des Endotoxintests verwendet werden kann, da die im produzierten Reinstwasser nachweisbaren Konzentrationen an Endotoxinen sehr gering sind (<0,001 EU/ml). Die erzielten Ergebnisse bestätigen frühere Versuche, in denen im Arium-Reinstwasser eine Endotoxinbelastung von <0,001 EU/ml gefunden wurde [4]. Die Endotoxinkonzentration im Arium-Reinstwasser liegt weit unterhalb der geforderten Grenzen gemäß United States Pharmacopoeia und es eignet sich daher theoretisch für die Herstellung und Endotoxin-Überwachung pharmazeutischer Produkte. Beispiele sind Produktformulierungen, Diafiltrationslösungen, Chromatographiepuffer, Wasser für Extraktions-, Sanitisierungsschritte oder Zellkulturlösungen. Um die Effekte sowie die Sensibilität von Zellen gegenüber Endotoxinen unter Kontrolle zu halten, sollten daher die Medien zum Anwachsen der Zellen frei von nachweisbaren Endotoxinen sein [5].

Literatur

[1] Steck, S.: Endotoxine und ihre Bedeutung bei R & D Applikationen. Bioforum 6/2006

[2] Endosafe-PTS Glucan Assay, Charles River Laboratories International, Inc, 2009

[3] Endotoxin Compendium, V 2.11, Hyglos GmbH, Bernried, Deutschland

[4] Untersuchungsbericht Fresenius Medical Care, Deutschland GmbH, Werk St. Wendel, 2007

[5] Dawson, M.E.: LAL Update von Associates of Cape Cod Incorporated, March 1998, Vol. 16, No. 1

Danksagung: Ein besonderer Dank der Autoren gilt Frau Dr. Stephanie Steck von der Firma Rentschler Biotechnologie für die Durchsicht des Manuskriptes sowie für die konstruktive Diskussion zum Thema.

* K. Schmidt: Sartorius Stedim Biotech GmbH, 37079 Göttingen

* *Dr. E. Herbig: Sartorius Weighing Technology GmbH, 37075 Göttingen

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