Reinstwasser Quantitative Endotoxinbestimmung von Reinstwasser

Für viele Reinstwasseranwendungen ist ein geringer Endotoxingehalt von grundlegender Bedeutung. Deshalb sind besonders zuverlässige Systeme gefragt, beispielsweise wenn es um hochreines Wasser für Applikationen im Bereich der Zellkultur geht.

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PCE Deutschland GmbH

Socorex Isba SA

Anton Paar Germany GmbH

Sartorius AG

Als Endotoxine werden Zellwandbestandteile Gram-negativer Bakterien (z.B. E.coli, Pseudomonaden) bezeichnet. Sie besitzen einen hydrophilen Polysaccharid- und einen lipophilen Lipidteil und sind – im Gegensatz zu den Bakterien aus denen sie stammen – sehr hitze- und pH-stabil. Endotoxine gehören zu den Pyrogenen, d.h. sie können bei Kontakt mit Schleimhäuten und bei einem Übertritt ins Blut Fieber erzeugen [1]. Laut gängiger Pharmakopöen dürfen im Herstellprozess pharmazeutischer Produkte die definierten Grenzwerte für den Gehalt an Endotoxinen nicht überschritten werden.

Test auf Endotoxine

Bei der Kultur von Säugetierzellen, die zur Herstellung biopharmazeutischer Produkte (z.B. Immunglobuline) eingesetzt werden, kann die Anwesenheit von Endotoxinen zum Zelltod führen. Daher müssen nachweislich unterhalb der Grenzwerte liegende, hochreine Medien bzw. hochreines Wasser zur Herstellung biopharmazeutischer Produkte oder zur Propagation von Zelllinien bzw. Zellkultur verwendet werden. Ziel dieser Untersuchung ist zu zeigen, dass das vom System Arium pro VF produzierte Reinstwasser einen Gehalt an Endotoxinen aufweist, der weit unterhalb vorgeschriebener Grenzwerte liegt und das erzeugte Reinstwasser für Anwendungen der oben genannten Art eingesetzt werden kann. Eine Methode zum Nachweis von Endotoxinen ist der so genannte LAL-Test (Lymulus-Amebocyte-Lysate), der sich die Gerinnung eines Lysates von Amöbozyten, das aus dem Pfeilschwanzkrebs (Limulus polyphemus) isoliert wurde, zu Nutze macht. Dabei handelt es sich um eine evolutionär primitive Gerinnungskaskade, welche über die sequenzielle Aktivierung von Proteasen zu einem Gerinnungspfropf führt. Die Gerinnungskaskade [2, 3] kann durch Endotoxine oder alternativ durch ß-Glukane (kurzkettige Polysaccharide aus der Zellwand von Hefen und Schimmelpilzen) ausgelöst werden. Wobei es bei dem Weg über ß-Glukane zu falsch positiven Aussagen kommen kann [1]. Das flüssige, farblose Lysat reagiert durch Koagulation zu einem festen milchigen Gel (sog. Gel-clot-Methode). Da die Empfindlichkeit des Lysates extrem hoch ist, ist es zwingend notwendig, eine falsch positive Reaktion durch eine Kontamination mit Endotoxinen oder ß-Glukane auszuschließen. Daher müssen an das Reinstwasser extrem hohe Reinheitsanforderungen gestellt werden. Neben der Gel-clot-Methode, kann der Endotoxin-Gehalt auch über eine quantitative chromogene Methode bestimmt werden. Das Lysat der chromogenen Methode enthält zusätzlich ein synthetisches chromogenes Peptid (chromogenes Substrat). Während bei der Gel-clot-Methode durch das Clotting-Enzym ein Gel clot entsteht, wird bei der chromogenen Methode durch das Clotting-Enzym das synthetische chromogene Substrat gespalten und führt zu einer Gelbfärbung. Die Stärke der Gelbfärbung steht in direkter Relation zum Endotoxingehalt der Probe (chromogener Test). Der Ansatz des Lysates (Gel-clot- oder Chromogene Methode) muss in hochreinem Wasser erfolgen.

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