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CHROMATOGRAPHIE

Säulenauswahl bei Optimierungsversuchen in der RP-HPLC

| Autor/ Redakteur: Stavros Kromidas* und Uwe Neue** / Marc Platthaus

In letzter Zeit hat das Verständnis über die Selektivität von RPPhasen durch die systematische Arbeit einiger Forschungsgruppen stark zugenommen [1-5]. Nachfolgend wird zunächst auf einige wichtige Ursachen für die Selektivitätsunterschiede von RP-Phasen eingegangen. Anschließend werden auf Basis experimenteller Daten Regeln zur Auswahl von RP-Säulen formuliert und ihre Aussagekraft für charakteristische Substanzklassen diskutiert.

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Abb.1: Trennfaktoren Ethylbenzol/Toluol an kommerziellen RP-Phasen in Methanol/Wasser
Abb.1: Trennfaktoren Ethylbenzol/Toluol an kommerziellen RP-Phasen in Methanol/Wasser
( Archiv: Vogel Business Media )

In letzter Zeit hat das Verständnis über die Selektivität von RP-Phasen durch die systematische Arbeit einiger Forschungs-gruppen stark zu-genommen (1-5).Nachfolgend wird zunächst auf einige wichtige Ursachen für die Selektivitätsunterschiede von RP-Phasen eingegangen. Anschließend werden auf Basis experimenteller Daten Regeln zur Auswahl von RP-Säulen formuliert und ihre Aussagekraft für charakteristische Substanzklassen diskutiert.

Die in [1-5] erwähnten Autoren haben an Hand umfangreicher Messungen bei unterschiedlichen experimentellen Bedingungen gezeigt, dass die dominanten Faktoren für die Selektivität in der RP-HPLC neben den allgemein angenommenen und erwarteten hydrophoben Wechselwirkungen sterische Aspekte und insbesondere polare Wechselwirkungen sind. Gerade letztere spielen mit Abstand die wichtigste Rolle.

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Der Grund dafür liegt in der Vielfalt von möglichen polaren Gruppen an der Oberfläche einer „üblichen“ C18-Phase, man könnte von einer nicht zu unterschätzenden „polaren Heterogenität“ sprechen: Absolute Konzentration an Silanolgruppen abhängig vom Bedeckungsgrad der Phasenoberfläche, Art der verbliebenen Silanolgruppen -Konzentration (freie, vicinale, geminale) und Art von Metallionen (Alkali-, Erdalkali- und Schwermetallionen sowie Al, was als saures Zentrum einen wichtigen Einfluß haben kann [6]), Siloxanbindungen, Rest-Amino-und sonstige polare Gruppen usw.

Die Unterschiede, die sich dadurch zwischen diversen C18/C8-Phasen ergeben, können enorm sein. Die Vielfalt an polaren Gruppierungen führt unweigerlich zu einer entsprechenden Vielfalt an möglichen polaren Wechselwirkungen: Ionenaustausch, Wasserstoffbrückenbindung, Dipol-Dipol- sowie Ion-Dipol-Wechselwirkungen, London-Kräfte, p...p-Wechselwirkungen oder Komplexbildung. Derartige Wechselwirkungen zwischen den Analyten und einer stationären RP-Phase sind eher der Normalfall, denn es gibt kaum Moleküle, die beispielsweise keinen Sauerstoff, Stickstoff oder eine Hydroxylgruppe enthalten - von Substanzklassen wie Alkanen vielleicht abgesehen, die in der HPLC sicherlich eine untergeordnete Rolle spielen.

Bei einigen moderneren Phasen kommen weitere polare Elemente hinzu: Zusätzliche polare Gruppen, um die polare Selektivität zu erhöhen (z.B. Platinum EPS, Enhanced Polar Selectivity), polare Gruppen in der Alkylkette (EPG, Eingebaute Polare Gruppe, z.B. Symmetry Shield), polare Endgruppe an der Alkylkette (z.B. SynergiPolar RP), hydrophiles Endcapping (z.B. Nucleodur C18 Pyramid), kurze, fluorierte Ketten (z.B. Fluofix) und vieles mehr. Entgegengesetzt dazu sind hydrophobe/lipophile Wechselwirkungen mehr oder weniger einheitlich, dadurch ist bei deren Dominanz während der Trennung nur eine geringe Differenzierung zwischen den Analyten möglich.

Erste Konsequenzen

Diese Tatsachen führen zu folgenden Konsequenzen:- Wenn bei einer Trennung vorwiegend hydrophobe Wechselwirkungen herrschen, werden nur geringe Selektivitätsunterschiede zwischen den Phasen beobachtet.- Je polarer die Phase, um so größer ist die Selektivitätsbandbreite bei der Trennung polarer Substanzen.

In Abbildung 1 sind die Trennfaktoren bei der Trennung Ethylbenzol/Toluol (Methylengruppenselektivität, „reiner“ RP-Mechanismus) an ca. 50 stationären Phasen zu sehen. Bis auf die sehr polare Phasen, zeigen auch sonst recht unterschiedliche Phasen sehr ähnliche Selektivitäten, die a-Werte bewegen sich zwischen 1,35-1,45. In Abbildung 2 sind die Trennfaktoren bei der Trennung Ethylbenzol/Fluorenon gezeigt. Hier sind durch die zusätzliche Gruppe bei Fluorenon polare Wechselwirkungen möglich. Dadurch können die Phasen ihren individuellen Charakter entfalten und das Ergebnis lautet:

Die Trennfaktoren bewegen sich zwischen a=1,00-1,65, es wird bei Spherisorb ODS1, Fluofix und Synergipolar RP sogar Elutionsumkehr beobachtet. Man sollte sich vergegenwärtigen, dass ausschließlich hydrophobe Wechselwirkungen - also ein „idealer“ RP-Mechanismus - auch in ungepufferten Systemen selten dominieren. Sogar große, hydrophobe, unsubstituierte Aromaten sind über induzierte Dipole zu polaren Wechselwirkungen in der Lage. In Abbildung 3 sind die Retentions- und Trennfaktoren (Balken bzw. Linie) bei der Trennung von Chrysen/Perylen dargestellt. Neben Phasen mit einer Polymerschicht an der Phasenoberfläche weisen gerade polare RP-Phasen eine sehr gute aromatische Selektivität auf. Hydrophobe, moderne, gut abgedeckte Phasen - die naturgemäß keine polaren Wechselwirkungen eingehen können - zeigen dagegen nur eine befriedigende Selektivität.

Ein RP-Mechanismus kann über den pH-Wert „erzwungen“ werden. Wird bei einem bestimmten pH-Wert ein einheitlicher Ionisierungszustand der zu trennenden Analyte erzielt, gerät ihr individueller, polarer Charakter in den Hintergrund, die Trennung erfolgt nun über ihren unterschiedlichen organischen Charakter. Und wie weiter oben erwähnt, führen apolare Wechselwirkungen zu einer geringen Selektivitätsbandbreite, die a-Werte sind klein und ähnlich. In Abbildung 4 sind die Retentions- und Trennfaktoren bei der Trennung von tricyclischen Antidepressiva in einem sauren Phosphatpuffer an diversen Phasen gezeigt.

Bei recht unterschiedlichen Retentionsfaktoren (blaue und rote Balken), abhängig vom hydrophoben Charakter der Phasen, werden sehr ähnliche Trennfaktoren erhalten (gelbe Linie). In solchen chromatographischen Systemen degradiert die stationäre Phase zu einem zweitrangigen Faktor im Optimierungsgeschehen, die Eluenten spielen die wichtigere Rolle (Abb. 5): große Bandbreite in den Retentionsfaktoren (Retentionszeiten), eine sehr kleine in den Trennfaktoren (Selektivitäten). Diese Phänomene werden sogar bei einfachen polaren, also nicht-ionisierbaren Analyten wie Ketonen beobachtet (Abb. 6).

Das Nicht-Ermöglichen von polaren Wechselwirkungen bei hydrophoben, gut abgedeckten Phasen, häufig im Zusammenhang mit einer Neutralisation von ionisierbaren Analyten über den pH-Wert, kann zwar zu einer guten Peaksymmetrie aber häufig zu einer mangelnden Selektivität führen. Auf diese Problematik wurde bereits an anderer Stelle hingewiesen [7]. Im vorliegenden Text ist häufig die Rede von polaren RP-Phasen. Im Kasten „Typen von polaren RP-Phasen“ sind Phasentypen aufgeführt, die aus unterschiedlichen Gründen einen mehr oder weniger polaren Charakter aufweisen.

Zusammenfassend kann bereits geschlussfolgert werden:

- Sind polare Wechselwirkungen möglich, bzw. werden solche durch beispielsweise den pH-Wert ermöglicht, so wird stets eine bessere Selektivität festgestellt.- Einheitlicher Mechanismus bedeutet, schnelle Kinetik bei gleichzeitiger geringen Differenzierung, das heißt: Gute Peaksymmetrie, häufig mangelnde/geringe Selektivität- Dualer Mechanismus bedeutet umgekehrt, häufig langsame Kinetik und damit schlechte Peaksymmetrie aber in aller Regel eine gute Selektivität. So lautete die Forderung z.B. für die Trennung stark polarer Analyte (Metabolite, Zersetzungsprodukte): Polare Wechselwirkungen ja, aber jene sollten nicht mit einer langsamen Kinetik einher gehen. Letzteres ist jedoch der Fall bei Anwesenheit von dissoziationswilligen Silanolgruppen und/oder weiteren, direkt an der Phasenoberfläche verankerten polaren Gruppierungen. Das Problem mit den Silanolgruppen ist, dass sie unter den C18-Gruppen „versteckt“ sind und deswegen schwer zugänglich sind. Silanolgruppen dagegen, die leicht zugänglich sind, erzeugen kein Tailing (Beispiel: HILIC an Kieselgel wie z.B. Atlanits HILIC).

Die Lösung in diesem Fall könnte lauten: Polare Gruppen an/in der Alkylkette, was schnelle Kinetik bedeutet, sterischer Schutz und entweder „keine“ freie Silanolgruppen an der Oberfläche der stationären Phase oder aber eine derart große Anzahl sterisch ungehinderter Silanolgruppen, die bei einer evtl. Wechselwirkungmit den Analyten nicht überladen sind, z.B. Zorbax SB C8, Fluofix, SynergiPolar RP, Atlantis. Eine weitere Schlussfolgerung lautet demnach: Es sind nicht die ionischen Wechselwirkungen, die zum chemischen Tailing führen, Tailing/Bandenverbreiterung entsteht, wenn durch bestimmte Mechanismen - hier ionische Wechselwirkungen - die Kinetik bei der Desorbtion des Analyten von der Oberfläche der stationären Phase verlangsamt wird.

Eignung hydrophober RP-Phasen

Eine RP-Phase mit einer hydrophoben, gut abgedeckten, homogenen Oberfläche hat zweifelsohne Vorteile, wenn es um die Trennung neutraler oder über den pH-Wert bzw. mit Hilfe Ionenpaar-Reagenzien neutralisierter Moleküle in der Routine geht, wenn(!) die Selektivität gegeben ist.

Deren Eignung dagegen sollte in folgenden Fällen kritisch beurteilt und die Selektivität sollte durch „cross-Experimente“ mit polaren Phasen überprüft werden: - Dissoziiert vorliegende Säuren und Basen- Stark polare Metabolite und Zersetzungsprodukte- „Schwierige“ Isomere- Mehrkernige, hydrophobe Aromaten (bedingt)- Planare/nicht planare Moleküle

An dem modernen, gut abgedeckten Inertsil ODS3 (Abb. 7 oben) sind polare Metabolite von tricyclischen Antidepressiva nicht optimal zu trennen, wohl aber am älteren, mit polaren „Verunreinigungen“ versehenen Inertsil ODS2 (Abb. 7 unten), siehe dazu auch Abbildung 8.

Am polaren Discovery Amid C16 (oben) wird eine bessere Selektivität als am hydrophoben Discovery C18 (unten) beobachtet. Stärkere Säuren (in Abb. 9 früh eluierend) werden am polaren Symmetry Shield C18 besser, schwache, die sich wie neutrale Moleküle verhalten und damit spät eluieren, am hydrophoben Synergimax RP besser getrennt. Auf die Wichtigkeit des Porendurchmessers, auch für die Trennung von kleinen Molekülen, wurde bereits hingewiesen [7].

Der sterische Aspekt darf somit bei der Säulenauswahl im Rahmen der Methodenentwicklung nicht außer Acht gelassen werden. Bei einer unbekannten Probe sollten demnach bei der Säulenauswahl allen drei Mechanismen Rechnung getragen werden: Hydrophobe Wechselwirkungen, polare/ionische Wechselwirkungen, sterische Aspekte. Man kann in den seltensten Fällen von vornherein die Relevanz des einen oder anderen Selektivitätsmoments ausschließen. In Tabelle 1 sind Phasen aufgeführt, die unterschiedliche Retentions-Mechanismen in der RP-HPLC abdecken.

Tabelle 2 zeigt eine größere Auswahl von hydrophoben bis hin zu polaren RP-Phasen mit jeweils einigen typischen Vertretern. Die aufgeführten Säulen sind nicht als Empfehlung für Trennungen zu verstehen, sie stellen vielmehr Beispiele für den jeweiligen Phasentyp dar [8].

Fazit

In letzter Zeit ist die Erkenntnis gewachsen, dass gerade in der RP-Chromatographie bis auf wenige Ausnahmen multiple Mechanismen vorherrschen - auch bei der Trennung vermeintlich einfacher Analyte. Deswegen sollten nicht nur die stationäre Phase, sondern auch alle übrigen Teilnehmer des chromatographischen Prozesses unter diesem Gesichtspunkt betrachtet werden.

Gemeint sind hier Aspekte, die bei der Auswahl des chromatographischen Systems nicht immer im Vordergrund stehen. Man sollte beispielsweise auch an die Bildung von Methanolaten, an die Stabilisierung von labilen Komplexen durch Acetonitril-Moleküle, an die Rolle des Probenlösungsmittels als Lösevermittler oder an eine mögliche Differenz zwischen dem pH-Wert der Probelösung und des Eluenten denken. Im Kasten „Auswahl: Säule, Eluent bei Optimierungsversuchen“ sind hierzu einige Abschlussbemerkungen als Denkanstösse formuliert.

*S. Kromidas, 66125 Saarbrücken**U. Neue, Waters, Milford/USA

Typen von polaren RP-Phasen

- Nicht-endcappte, Metall-Ionen kontaminierte Phasen- Polare (Rest-)Gruppen an der Oberfläche- Geringe Belegung, dadurch hohe Gesamt-Silanolgruppenkonzentration- Eingebaute polare Gruppen („embedded phases“)- Hydrophil-endcappte Phasen („AQ“)- Fluorierte Phasen- Kurze Alkylketten- Kombinationen, z.B. Kurze Alkylkette + eingebaute polare Gruppe + polare Endgruppe + hydrophiles Endcapping- Polare Klassiker, z.B. Phenyl, Nitril, Diol

Auswahl: Säule, Eluent bei Optimierungsversuchen

- Hydrophobe RP-Phasen sind am unproblematischten und sollten stets die erste Wahl sein – wenn die Selektivität gegeben und überprüft worden ist!- Ermögliche bei „schwierigen“ Trennungen polare Wechselwirkungen!- Bei der Trennung polarer Komponenten sind selektive Systeme oft nicht robust – und umgekehrt- Wichtig bei einer unbekannten Probe sind alle drei Selektivitätsaspekte: hydrophobe -, polare Wechselwirkungen, Sterik- Probelösungsmittel und Eluenten-Moleküle nehmen in aller Regel amTrennungsgeschehen aktiv teil – wichtig bei der Eluentenzusammensetzung ist nicht nur die Elutionsstärke

Literatur:[1]L.R. Snyder, J.W. Dolan, „Column Selectivity“ in S. Kromidas (Hrsg.) „HPLC-Tipps Band 3, Optimierung in der HPLC“, in Vorbereitung[2]M.R. Euerby and P. Petersson, J. Chromatogr. A, 994(2003) 13[3]U.D. Neue et al., Chromatographia 2001, 54, 169-177[4]Cinzia Stella, Vortrag anlässlich der HPLC 2003, Nice[5]S. Kromidas, Studie „Vergleich und Auswahl von kommerziellen RP-HPLC-Säulen“, 2002, Pirrot Verlag, Saarbrücken[6]H. Zobel, GIT Spezial Separation, 2000[7]S. Kromidas, „HPLC-Tipps Band 2“, 2004, Hoppenstedt Bonnier Verlag, Darmstadt [8]S. Kromidas, „Die Säule als Optimierungsfaktor in der RP-HPLC“ in S. Kromidas (Hrsg.) „HPLC-Tipps Band 3, Optimierung in der HPLC“, in Vorbereitung

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Marc Platthaus

Marc Platthaus

Chefredakteur, LABORPRAXIS - Mehr Effizienz für Labor & Analytik