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Klar- und Sterilfiltration von Antikörpern in einem Schritt

Schnelle Zellernte ohne Zentrifuge

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Material und Methoden

Suspensionsadaptierte HEK293- oder CHO-Zellen werden in serumfreien Medien kultiviert, die mit DNA-Plasmiden zur Codierung der schweren und leichten Kette des monoklonalen Antikörpers transfiziert werden. Sechs bis 14 Tage nach der Transfektion erfolgt die Zellernte zur Aufreinigung.

Bei einer normalen Expressionscharge von 1 Liter würde der bis dahin übliche Klärungsprozess eine 45-minütige Zentrifugation mit 3500 g in einer Tischzentrifuge (2 × 500 ml) und anschließende Filtration durch mindestens einen Vakuum-Flaschenaufsatzfilter mit 0,45-µm-PES-Membran erfordern. Der filtrierte Überstand wird zur Antikörperbindung und -elution bei niedrigem pH in ein ÄKTA-Aufreinigungssystem mit einer 5-ml-Protein-A-Säule gefüllt. Der Antikörper wird neutralisiert und entweder weiteren Aufreinigungsschritten unterzogen (z.B. Kationenaustausch oder Größenausschluss-Chromatographie) oder gelangt je nach Anforderungen der Antikörpercharge direkt in die Qualitätskontrolle. Diese wird mittels SDS-PAGE (unter nicht-reduzierenden und reduzierenden Bedingungen), SEC-HPLC, LAL-Test und ggf. ELISA für die Messung der Bindungsaktivität durchgeführt (s. Abb. 2).

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Im modifizierten Downstream-Prozess werden die Schritte Zentrifugation und Filtration durch Sartoclear Dynamics Lab V ersetzt. Einer 1-Liter-Zellkultur wurden 20 g Kieselgur-Filtrierhilfe hinzugegeben. Zellen und Kieselgur werden kräftig gemischt und anschließend direkt in eine im Sartoclear Dynamics Lab Kit enthaltene Vakuumfiltereinheit Typ Sartolab RF mit einem Aufnahmevermögen von 1000 ml und 0,22-µm-PES-Membran gegossen. Nach Anlegen eines Vakuums wird die geklärte Zellkulturflüssigkeit in einer 1-Liter-Flasche aufgefangen. Danach durchläuft das Filtrat den oben beschriebenen Aufreinigungs- und Qualitätskontrollprozess.

Ergebnisse und Diskussion

Zur Evaluierung des Sartoclear Dynamics Lab V im Vergleich zum Standardprozess wurde eine Zwei-literkultur eines IgG1 Anti-EGFR-Humanantikörpers (Cetuximab; Absolute Antibody-Katalognummer Ab00279-10.0) in HEK293-Zellen vorbereitet. Sechs Tage nach der Transfektion wurde die Kultur in zwei gleiche Volumina aufgeteilt. Zum Zeitpunkt der Ernte betrug die Zelldichte 2,4 × 106 Zellen/ml mit einer Viabilität von 65%.

Für den ersten Liter Zellkultur wurde auf den konventionellen Prozess zurückgegriffen (s. Abb. 2). Dies erforderte einen 45-minütigen Zentrifugationsschritt und anschließende Filtration durch drei 500-ml-Flaschenaufsatzfilter mit einer 0,45-µm-PES-Membran. Diese Filter sind normalerweise nach Filtration von 400 ml Überstand verblockt, sodass im Schnitt pro Liter Zellkultur drei Filter benötigt werden. Es wurden keine Filter mit einer Porengröße 0,22 µm verwendet, um das Überstandsvolumen zu erhöhen, das vor dem Verblocken filtriert werden kann. Die Filtration von 1 Liter Zellen erforderte eine Arbeitszeit von 9 Minuten und 48 Sekunden. Dies entspricht einer Gesamtbearbeitungszeit von ca. 55 Minuten.

Der zweite Liter durchlief den Sartoclear-Dynamics-Lab-V-Prozess. Den Zellen wurden zwei 10-Gramm-Beutel Kieselgur zugegeben. Anschließend wurde kräftig gemischt. Danach wurden die Zellen in einen 1000 ml/0,22 µm-Sartolab-RF-Filter gegossen und Vakuum angelegt. Die Filtration wurde ohne Verblocken abgeschlossen und dauerte insgesamt 8 Minuten und 27 Sekunden ab Kieselgurzugabe bis zur Beendigung des Filtrationsvorgangs. Die benötigte Zeit entspricht ca. 15% der Zeit, welche die konventionelle Methode (s. Abb. 3) erforderte. Zur Bestätigung, dass der Prozess mit Sartoclear Dynamics Lab V die Qualität der Antikörper nicht beeinträchtigte, durchliefen die beiden Proben separat die Aufreinigungs- und Qualitätskontrollprozesse.

Die final aufgereinigten Antikörper wiesen keine erkennbaren Unterschiede in der Produktqualität auf. Dies konnte anhand SDS-PAGE (s. Abb. 5) bzw. SEC-HPLC (s.  Abb. 6) gezeigt werden. Für jede Probe wurde der Endotoxin-Gehalt bestimmt, der jeweils einen Messwert von <0,05 EU/mg ergab. Dies entspricht der unteren Detektionsgrenze des routinemäßig verwendeten Test-Kits. Zur Bestätigung, dass der modifizierte Prozess keinen Einfluss auf die Funktion des Antikörpers ausübte, wurde ein indirekter ELISA-Test durchgeführt, der die Bindung an Human-EGFR-Fc (Absolute Antibody Kat.-Nr. Pr00117-10.9) zeigen konnte. Wie in Abbildung 4 veranschaulicht, hatte die Methode der Zellklärung keine Auswirkung auf die Bindungsaktivität. Überdies war die Endausbeute der beiden Prozesse annähernd identisch. Dies verdeutlicht, dass Kieselgur weder in qualitativer noch in quantitativer Hinsicht Einfluss auf den Antikörper hat.

Fazit

Es konnte zweifelsfrei nachgewiesen werden, dass Sartoclear Dynamics Lab V die schnelle Klärung von Säugetierzellkulturen ohne Zentrifugationsschritt ermöglicht. Dazu wurden zwei Liter einer mit einem Antikörper transient transfizierten Zellkultur verwendet und für deren Aufreinigung ein standardmäßiger Zentrifugations-Klärprozess mit dem auf Kieselgur-basierten Sartoclear-Dynamics-Lab-V-Prozess verglichen. In zahlreichen Messungen (SDS-PAGE, SEC-HPLC, ELISA und Endotoxine) konnten keinerlei signifikante Unterschiede in Menge und Qualität des Endprodukts festgestellt werden.

Damit ist nachgewiesen, dass das auf Kieselgur basierte System keinen Einfluss auf die Produktqualität ausübt. Vor allem ergab der Sartoclear-Dynamics-Lab-V-Prozess eine eindrucksvolle Zeiteinsparung von ca. 85%. Damit stellt Sartoclear Dynamics Lab V eine attraktive Option zur Steigerung der Produktivität und des Durchsatzes für den Klärschritt bei Expressions- und Aufreinigungssystemen für sekretierte Proteine dar.

Literatur:

[1] Kempken, R., Preissmann, A., and Berthold, W. (1995). Clarification of animal cell cultures on a large scale by continuous centrifugation. J. Ind. Microbiol. 14, 52–57.

[2] Liu, H.F., Ma, J., Winter, C., and Bayer, R. (2010). Recovery and purification process development for monoclonal antibody production. MAbs 2, 480–499.

[3] Riske, F., Schroeder, J., Belliveau, J., Kang, X., Kutzko, J., and Menon, M.K. (2007). The use of chitosan as a flocculant in mammalian cell culture dramatically improves clarification throughput without adversely impacting monoclonal antibody recovery. J. Biotechnol. 128, 813-823.

* J. Stephenson, C. Bladen, I. Wilkinsone Absolute Antibody Ltd, Redcar, TS10 4RF, Großbritannien

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