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Klar- und Sterilfiltration von Antikörpern in einem Schritt Schnelle Zellernte ohne Zentrifuge

| Autor/ Redakteur: James Stephenson, Catherine Bladen & Ian Wilkinson* / Dr. Ilka Ottleben

Ob Grundlagenforschung oder Biopharmazeutika – monoklonale Antikörper erfreuen sich eines enorm breiten Einsatzspektrums. Die Ernte von Säugetierzellkulturen indes war bislang – auch im Labormaßstab – zeitaufwändig und beinhaltete meist einen Zentrifugationsschritt. Eine neue Kieselgur-basierte Filtrationslösung verbessert und verkürzt diesen Prozess nun deutlich.

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Ohne Zentrifugation: Die Sartoclear Dynamics Lab Kits ermöglichen die Klärung und Sterilfiltration von Säugetierzellkulturen in einem einzigen Schritt.
Ohne Zentrifugation: Die Sartoclear Dynamics Lab Kits ermöglichen die Klärung und Sterilfiltration von Säugetierzellkulturen in einem einzigen Schritt.
(Bild: Sartorius AG)

Monoklonale Antikörper werden für ein breites Anwendungsspektrum z.B. in der biopharmazeutischen Entwicklung, Grundlagenforschung und In-vitro-Diagnostik verwendet. Expressionssysteme für monoklonale Antikörper benötigen in der Regel ein Signalpeptid, um die Antikörpersekretion in die Zellkulturmedien zu ermöglichen.

Obwohl dadurch die Komplexität der Aufreinigung reduziert wird und die Notwendigkeit des Zellaufschlusses entfällt, müssen dabei kostenaufwändige und/oder zeitraubende Verfahren eingesetzt werden, um die Zellen von der Antikörper enthaltenden Zellkulturflüssigkeit abzutrennen. Das betrifft die Produktion von Antikörpern mittels Säugetierzellen generell, egal ob die standardmäßige Produktion mit Hybridomazellen oder die rekombinante Produktion in Zelllinien chinesischer Hamster­ovarien (CHO) sowie menschlicher embryonaler Nierenzellen (HEK). Im Bioreaktor-Maßstab, der normalerweise über 50 Liter umfasst, werden dazu Verfahren wie kontinuierliche Zentrifugation und Tiefenfiltration eingesetzt [1, 2].

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Im Forschungsmaßstab (normalerweise weniger als 10 Liter Zellkultur pro Antikörper) erweisen sich diese Verfahren hingegen als unpraktikabel und kostspielig. Bei der am häufigsten zitierten Methode zur Klärung im Forschungsmaßstab kommt ein initialer Zentrifugationsschritt mit anschließender Filtration des geklärten Überstands durch einen 0,2-, 0,22- oder 0,45-µm-Filter zur Anwendung, und zwar entweder mit einem handbetriebenen Spritzenvorsatzfilter oder einem Vakuum-Flaschenaufsatzfilter. Diese Lösungen sind preisgünstig und einfach mit Standardgeräten zu handhaben, die in den meisten biotechnologischen Laboren vorhanden sind. Wegen des flachen Designs verblocken diese Filter jedoch leicht durch gelöste Partikel im Submikrometerbereich [2].

Bei dem auf die Expression, die Sequenzierung und das Engineering von Antikörpern spezialisierten britischen Unternehmen Absolute Antibody werden rekombinante Antikörper transient in HEK293- und CHO-K1-Zellen exprimiert. Bei einer wöchentlichen Gesamtproduktion von etwa 100 Litern Zellen wird dabei normalerweise mit ca. 50 Antikörpern pro Woche in einer Größenordnung von 30 ml bis zu 20 Litern gearbeitet. Die Aufreinigung aller Antikörper erfolgte in den letzten sechs Jahren durch Zentrifugation und anschließende Filtration mit Flaschenaufsatzfiltern.

Mit steigender Produktionskapazität stieg auch der Bedarf an Zentrifugen. Hinzu kam, dass sich Separationslösungen, wie Filter für das „Homebrewing“ und Ausflockungsmittel wie Chitosan [3], als anfällig für Verblockungen sowie durchsatzschwach und qualitativ minderwertig (z.B. durch Endotoxin-Kontaminationen) erwiesen haben. Das Filtrationssystem Sartoclear Dynamics Lab V (Sartorius AG, Göttingen) wurde entwickelt, um den mit der Klärung von Säugetierzellkulturen verbundenen Zeit- und Arbeitsaufwand zu reduzieren. Die Zugabe von Kieselgur (DE) zur Zellkultur unterstützt die Bildung eines porösen Filterkuchens, der das Verblocken des Filters verhindert und gleichzeitig die schnelle Abtrennung von Zellen und Zelldebris aus der Probe ermöglicht (s. Abb. 1). Auf diese Weise lässt sich der Zentrifugationsschritt vermeiden, Probleme mit der Zentrifugenkapazität und -verfügbarkeit werden umgangen und ein Verblocken der Filter verhindert.

In der im Folgenden vorgestellten Untersuchung wurde das Filtrationssystem Sartoclear Dynamics Lab V getestet und mit dem Standardprozess von Absolute Antibody verglichen.

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