LIQUIDHANDLING Selektivitätsverhalten moderner HPLC-RP-Phasen

Nach einer relativ ruhigen Zeit Anfang der 90er Jahre wurden in den letzten 6-8 Jahren verstärkt neue RP-Säulen eingeführt. Im Folgenden werden die Selektivitätsunterschiede der wichtigsten modernen RP-Phasentypen vorgestellt und kurz diskutiert.

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Nach einer relativ ruhigen Zeit Anfang der 90er Jahre wurden in den letzten 6-8 Jahren verstärkt neue RP-Säulen eingeführt. Die Bandbreite reicht von sehr polaren, nahezu Kieselgelähnlichen „RP“-Phasen bis hin zu ausgesprochen hydrophoben, Polymer-ähnlichen Materialien. Im Folgenden werden die Selektivitätsunterschiede der wichtigsten modernen RP-Phasentypen vorgestellt und kurz diskutiert.

Die Situation bezüglich Phasentechnologie Ende der 80er Jahre stellt sich vereinfacht wie folgt dar:

- Man war in der Lage, eine hydrophobe, gut abgedeckte Phasenoberfläche zu kreieren, die „aggressiven“, freien Sila-nolgruppen wurden aus dem aktiven Geschehen weitgehendst verbannt.- Bereits damals wiesen die Materialien durch synthetisch-hergestellte Kieselgele eine erstaunliche Reinheit auf.

Das Erreichen dieser zwei Ziele führte dazu, dass die Phasen eine hervorragende Peaksymmetrie auch für stark basische Komponenten lieferten (Abb. 1). An einer gut abgedeckten Oberfläche (links) eluieren die Basen Pyridin und Benzylamin sogar in ungepufferten Eluenten mit einer guten Peaksymmetrie, an einem silanophilen Material (rechts) wird erwartungsgemäß starkes Tailing festgestellt. Moderne, hydrophobe Phasen weisen jedoch zwei Nachteile auf. Durch die generell gute Abdeckung der Phasenoberfläche bei modernen, hydrophoben RP-Phasen entfällt ein wichtiges Unterscheidungsmerkmal der Phasen, jene werden aneinander ähnlich, was an den Selektivitätshexagonen von Discovery C18, Hypersil BDS, Jupiter, Hypersil HyPurity und Kromasil in Abb. 2 zu erkennen ist. Mit Hilfe dieser Darstellung kann die Ähnlichkeit von Säulen bei gegebenen Bedingungen und für bestimmte Substanzklassen leicht überprüft werden [1].

Die gut abgedeckte, hydrophobe Oberfläche, die ja nun über kaum reaktive Silanolgruppen verfügt, ist naturgemäß zu ionischen/polaren Wechselwirkungen nicht in der Lage. Das Ergebnis lautet: Hervorragende Peaksymmetrie für Basen im Sauren/Neutralen aber vielfach mangelnde Selektivität für polare Spezies. Diese Problematik wird in Abb. 3 bei der Trennung von Uracil (Inertmarker), Pyridin, Benzylamin, Phenol im sauren (pH 2,7) Phosphatpuffer demonstriert. An einem stark silanophilen Material (links) wird wie erwartet ein starkes Tailing bei den Basen beobachtet. An einem modernen, hydrophoben, endcappten Material (rechts), an dem ionische/polare Wechselwirkungen nicht möglich sind, eluieren beide Basen als ein symmetrischer Peak (1,1 min), der hier sogar vor dem Inertmarker eluiert (Ionenausschluss).

In dieser guten Peaksymmetrie birgt sich allerdings eine Gefahr: An gut abgedeckten, hydrophoben Phasen täuscht eine gute Peaksymmetrie häufig eine ebenfalls gute Selektivität vor (siehe in Abb. 3 am polaren Material vier, am hydrophoben Material drei Peaks); stark basische Komponenten koeluieren und bleiben dadurch unerkannt. Die Lösung kann hier lauten: Polare Wechselwirkungen ja, Silanolgruppen, nein. Die Forderung von polaren Wechselwirkungen ohne Silanolgruppen erfüllen Phasen, die durch ihre polare Funktionalität zu ionischen/polaren Wechselwirkungen in der Lage sind (gute Selektivität) aber andererseits keine reaktive Silanolgruppen an der aktiven Phasenoberfläche besitzen, die für eine langsame Kinetik verantwortlich sind (gute Effizienz).

Eine Alternative stellen Phasen dar, an deren Oberfläche sich eine große Anzahl an aktiven Sila-nolgruppen befindet: Die Überladung wird dadurch vehindert, das Ergebnis ist eine gute Kinetik bei der Desorption einer polaren/ionischen Komponente von der Phasenoberfläche und folglich eine gute ?Peaksymmetrie. Beispiele für polare Phasen, die neben der guten Selektivität auch eine gute Peaksymmetrie für polare/basische Komponenten liefern, wären einmal das sterisch geschützte Zorbax SBC8, das hydrophil endcappte, "embedded phase"-Material SynergiPOLAR RP und Fluofix, das eine kurze (C7), fluorierte Alkylkette aufweist (Abb. 3, Mitte). Eine weitere Möglichkeit, um bei der Methodenentwicklung wenigstens der Wahrheit näher zu kommen, wäre folgende: Man führt zunächst die Trennung basischer Komponenten wie gewohnt an hydrophoben Phasen durch. Doch sollte vor der Validierung bzw. Übernahme der Methode in der Routine als letzte Bestätigung für die Peakhomogenität, die Trennung an einem nicht endcappten, silanophilen Material evtl. sogar mit Hilfe eines ungepufferten Eluenten wiederholt werden.

Parallelentwicklung der letzten Jahre

Die Einführung von stark polaren Wirkstoffen vor allem in der Pharmaforschung aber auch im Pflanzenschutz machte die Entwicklung von modernen, polaren RP-Phasen notwendig. Benötigt wurden Phasen, die sowohl über polare Funktionalitäten an der Oberfläche verfügen - und somit selektiv für polare Analyten sind - als auch durch die fehlenden aktiven Silanolgruppen und Metallionen an der Kieselgelmatrix eine gute Effizienz gerade für basische Komponenten zeigen.

Die Antwort der Säulenanbieter lautet hydrophil endcappte Phasen und insbesondere „embedded phases“. Die Polarität der eingebauten Gruppe bei den „embedded phases“ variiert stark und somit der polare Cha-rakter dieser modernen polaren Phasen: Von Carbamat und Harnstoff über Amid bis hin zu Ether und einer „ion-pair-ing group“, um mit Hilfe letzterer auf die klassische Ionenpaarchromatographie verzichten zu können. Parallel zu dieser Entwicklung wurde das „klassische“ Ziel, eine hydrophobe, gut abgedeckte Oberfläche zu erhalten, weiterhin verfolgt. Diese Bemühungen führten zu der erstaunlichen Bandbreite von modernen „RP“-Alkylphasen: Von sehr polaren, fast CN- und Diol-ähnlichen Phasen (z.B. Platinum EPS, Synergi POLAR RP, Hypersil Advance, Zorbax Bonus) bis hin zu äußerst hydrophoben Phasen (z.B. SMT, Nucleosil HD/AB, Synergi Max RP, Zorbax Extend).

Des weiteren wird versucht, zwei alte Wünsche vieler HPLC-Anwender zu erfüllen: Man möchte zum einen auch im Alkalischen arbeiten können, ohne, dass das Kieselgel schnell aufgelöst wird und zum anderen sollte die Analysenzeit möglichst kurz sein. Ersteres Ziel wurde mit befriedigendem Erfolg u.a. durch spezielle Bindungstechniken (z.B. „Brückenbindung“, Zorbax Extend) oder durch die Entwicklung von Hybridmaterialien (z.B. XTerra, XTerraMS) erreicht. Immer wieder aktuell in der Diskussion sind Zirkon- und Titandioxid als alternative Matrices zum Kieselgel. Das zweite Ziel wurde durch die konsequente Miniaturisierung - in der Zwischenzeit gibt es eine Reihe von 20 bis 25 mm Säulen, häufig mit 3,5 µm Material gefüllt - und mit Hilfe von Monolithen (z.B. Chromolith Performance) verfolgt. Die Monolithen werden bereits als ebenbürtige Alternative zu den partikulären Materialien angesehen.

Von „Polarität“ und „Silanophilie“

Es ist nicht einfach, von der Polarität/Silanophilie einer Phase zu sprechen [1].

Fluofix und Zorbax SBC8 bspw. sind polare aber durchaus nicht silanophile Phasen. Zorbax ODS und Hypersil ODS verfügen zwar beide über stark saure (freie) Silanolgruppen, Zorbax ODS jedoch weist gegenüber Hypersil ODS eine weit größere Gesamt-Silanolgruppen-Konzentration. Bei Abwesenheit von basischen Analyten verhält sich Zorbax ODS durch die starke Belegung (ca. 17% C) allerdings als eine recht hydrophobe Phase. Das hydrophile Endcapping schließlich verleiht den „AQ“-Phasen einen nur geringfügig polareren Charakter in Vergleich zu den hydrophoben „Klassikern“. Heute gibt es einen fast nahtlosen Übergang vom polaren Kieselgel (einige Kieselgele mit einer hohen Konzentration an Siloxanbindungen zeigen einen gewissen „hydrophoben“ Charakter) hin zu den polymeren oder polymerisierten RP-Phasen. Diese Differenzierung erscheint jedoch aus Anwendersicht weniger hilfreich zu sein.

Selektivität von modernen Phasen

Zur Übersicht der Selektivitätseignung siehe Kastentext „Selektivitätseigenschaften“ [1, 2]. Der polare Charakter von C18/C8-Alkylphasen nimmt in folgender Reihenfolge ab.

- Polare Gruppierungen an der Oberfläche, z.B. Supelcosil ABZ PLUS, Platinum EPS- Hohe Gesamt-Silanolgruppen-Konzentration, z.B. Resolve, Spherisorb ODS1- “embedded phases” (C16 bis C3), z.B. ProntoSIL ACE, Nucleosil Nautilus- Geringe Belegung der Oberfläche, z.B. Atlantis, Platinum C18 -Endcappte, dennoch silanophile, Metallionen-haltige Phasen, z.B. Bondapak- Hydrophil endcappte Phasen („AQ“-Phasen), z.B. YMC AQ, MultospherAQ

Darüber hinaus wären Kombinationen zu nennen (z.B. Synergi POLAR RP) oder „klassische“ polare RP-Phasen wie CN oder Diol.

Vereinfacht kann geschlußfolgert werden:

- Apolare Substanzen können in einem ungepufferten Eluenten an polaren Phasen selektiv getrennt werden. In dem Maße, wie der polare Charakter der Analyten zunimmt, werden in gleichem Maße apolare Phasen benötigt.- Polare Substanzen können in ungepufferten Eluenten an apolaren Phasen gut getrennt werden. Das gilt auch für solche, die durch Isomerie oder durch einen Substituenten eine Differenz in ihrem polaren Charakter aufweisen, z.B.: OH bzw. H vs. CH3 oder CH2 vs. C=O.- Polare Substanzen werden in gepufferten Eluenten an polaren, apolare Analyte an apolaren Phasen gut getrennt.

Für eine gute Selektivität wird im ungepufferten Eluenten Gegensätzlichkeit, in gepufferten Eluenten Gleichheit zwischen dem Charakter des Analyten und der stationären Phase benötigt. Diese Gesetzmäßigkeiten gelten für eine Reihe untersuchter Analyttypen. Für eine allgemeingültige Aussage bedarf es selbstverständlich der weiteren Verifizierung durch Messung weiterer Substanzklassen. Ebenso bezieht sich die „Eignung“ hier ausschließlich auf die Selektivität, nicht auf die Peaksymmetrie. Man scheint sich heute einig darüber zu sein, dass bis auf wenige Ausnahmen, in der RP-Chromatographie bezüglich Selektivität polare Wechselwirkungen (Ionenaustausch, Wasserstoffbrückenbindungen, Dipol-Dipol-Wechselwirkungen) und sterische Aspekte weit wichtiger als hydrophobe Wechselwirkungen sind. Neben den dominanten polaren Wechselwirkungen können sterische Aspekte auch für kleine Moleküle einen entscheidenden Einfluß auf die Selektivität haben.

Polare Wechselwirkungen, die von polaren Phasen wie dem nicht-endcappten, silanophilen LiChrosorb und den hydrophil-endcappten ReproSil AQ den Analyten sicherlich „angeboten“ werden, reichen hier für eine vollständige Trennung von polaren Metaboliten offensichtlich nicht aus (linkes und mittleres Chromatogramm, 5 Peaks). Erst der sterische Aspekt, bedingt durch den Porendurchmesser von 300A, liefert die notwendige Selektivität, um alle sechs Metabolite trennen zu können. Wie könnte nun eine hypothetische "super-selektive" Universalsäule aufgebaut sein? Stark vereinfacht, bräuchte man ein modernes LiChrospher oder Zorbax ODS auf Basis eines Alkali-resistenten Kieselgels in zwei Varianten: 50 und 300 A. Wie weiter oben angemerkt, sind für die Selektivität folgende drei Faktoren relevant: Hydrophobie, Silanophilie und sterische Aspekte. Eine Phase, die über diese drei Eigenschaften verfügt, böte für nahezu jeden Analyttyp in der RP-HPLC die notwendige Voraussetzungen für eine Trennung.

- „modern“: synthetisches, Metallionen-armes Kieselgel- „Alkali-resistent“: Bei Bedarf Trennungen im Alkalischen möglich- 50, 300 A: Für evtl. notwendige sterische Aspekte wird vorgesorgt-nicht endcappte Materialien: Ionenaustausch-Wechselwirkungen möglich- Hohe Gesamtsilanolgruppen-Konzentration: Polare Wechselwirkungen wie Wasserstoffbrückenbindungen, Dipol-Dipol-Wechselwirkungen möglich

Die Wechselwirkungen würden dann für jede Substanzklasse individuell über den Eluenten gesteuert, z.B. +/- 5% Tetrahydrofuran, n-Butanol etc. für neutrale Komponenten, +/- 0,5 pH-Einheiten für ionische Komponenten. Die letztendliche Trennungsoptimierung - vor allem mit Focus auf die Analysenzeit - würde über den Gradienten (Anfangs- und Endprozente an B, Steilheit, Gradientenvolumen) und die Temperatur erfolgen.

Methanol oder Acetonitril?

Es wurden mehrere Experimente mit diversen Kombinationen „Phase-Eluent-Analyttyp“ durchgeführt. Aus den Ergebnissen kristallisiert sich für mehrere Substanzklassen folgende Regel: In Acetonitril ist die Peakform wegen der geringen Viskosität generell besser als in Methanol. Es scheint jedoch so zu sein, dass für eine Reihe von Substanzklassen Methanol die bessere Selektivität bei einer allerdings längeren Retentionszeit zeigt (Eluentenmischungen gleicher Elutionskraft).

Fazit: Sind womöglich polare/ionische Wechselwirkungen für die Selektivität nicht relevant, so wären bei einer Methodenentwicklung hydrophobe, gut abgedeckte Phasen die erste Wahl: sie sind flexibel einsetzbar, liefern in aller Regel symmetrische Peaks und die Chargenreproduzierbarkeit dürfte im Vergleich zu polaren Phasen ein geringeres Problem darstellen.

Schließlich zeigen sie in der Routine eine gute Stabilität. Phasen dagegen mit einer polaren Funktionalität scheinen für die Trennung von Substanzen mit ähnlichem hydrophoben/polaren Charakter eher geeignet zu sein, z.B. isomere Verbindungen, stark polare Metaboliten, stärkere Säuren, hydrophobe Aromaten sowie planare/nicht planare Moleküle.

SELEKTIVITÄTSEIGENSCHAFTEN

Eignung polarer Phasen:Ungepufferte Eluenten- Hydrophobe, unsubstituierte „große“ Aromaten- Planare/nicht planare Aromaten- Isomere (Stellungs-, Doppelbindungsisomere)

Gepufferte Eluenten- Basische Substanzen; die gute Selektivität rückt jedoch durch die häufig schlechte Peakform in den Hintergrund- Mittelstarke (dissoziiert vorliegende) Säuren- Stark polare Metabolite

Eignung hydrophober Phasen:

Ungepufferte Eluenten- polare bis apolare, kleine, neutrale organische Moleküle (Aldehyde, Hydroxybenzoate, einkernige Aromaten)- Analyte unterschiedlicher Polarität; die Differenz im polaren Charakter kann hervorgerufen sein, sowohl durch eine Gruppe (C = O, CH2 usw.) als auch durch Isomerie.

Gepufferte Eluenten- schwache Säuren (undissoziiert vorliegend)- organische Basen

Literatur

[1] Stavros Kromidas, „Eigenschaften von kommerziellen C18-Säulen im Vergleich“, 2002, Pirrot Verlag, Saarbrücken[2] Stavros Kromidas, „HPLC-Tipps, Band 2“, 2003, Hoppenstedt Bonier Verlag, Darmstadt

*S. Kromidas, 66125 Saarbrücken

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