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Optimierte HPLC

So gelingt die nachhaltige und robuste HPLC-Trennungsoptimierung

| Autor/ Redakteur: Hans-Werner Bilke* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

„Green Chromatography“ – Toxische organische Lösungsmittel vermeiden und die absolute Lösungsmittelmenge verringern sind zwei Ziele dieser nachhaltigeren Arbeitsweise.

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Abb.1: Empirisches Multi-Faktor-/Multi-Zielgrößen-Modell der 7-Faktor-Trennoptimierung
Abb.1: Empirisches Multi-Faktor-/Multi-Zielgrößen-Modell der 7-Faktor-Trennoptimierung
(Bild: Bilke)

Einerseits können Lösungsmittel durch Verringerung der Säulendimensionen (Durchmesser, Säulenlänge) eingespart werden. Andererseits können durch die simultane Trennungsoptimierung in der HPLC-Methodenentwicklung sowohl die Analysezeit als auch die Menge an toxischen Lösungsmittel zielführend optimiert werden. Nur dann kann gleichzeitig die Einhaltung der Selektivität und Robustheit der HPLC-Trennung gewährleistet werden. Die Basis dafür ist ein umfassendes Verständnis des flüssigchromatographischen Trennprozesses und ein definierter Design Space (Method Operable Design Region = MODR) für die HPLC-Trennung.

Der Design Space ist ein unregelmäßiges, sehr komplexes Volumen, das mit einer Matrix von Wahrscheinlichkeiten beschrieben und in einer graphischen Darstellung des resultierenden Bereichs (Fläche oder Volumen) wiedergegeben werden kann.

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Chromatographie und statistische Versuchsplanung als Einheit

Die robuste Optimierung der HPLC-Trennung selbst kann mit den Methoden der Versuchsplanung durchgeführt werden, weil anders keine zuverlässigen Aussagen über die größte mögliche zulässige „Operable Design Region“ gemacht werden können. Regulatorische Flexibilität ist für Bewegungen innerhalb des definierten Design Space gewährleistet. Für eine sichere Einschätzung des Design Space benötigt man einen gut strukturierten Ansatz und eine hohe Datenqualität. Die Einheit von Chromatographie und statistischer Versuchsplanung (DoE) ist der effektivste Ansatz, um diese Ziele zu erreichen.

Die Qualität eines nachhaltigen flüssigchromatographischen Trennprozesses hängt von einer Vielzahl von Einflussgrößen und Zielgrößen ab. Wichtige Zielgrößen zur Verringerung der absoluten Lösungsmittelmenge im flüssigchromatographischen Trennprozess sind die Auflösung Rs aller Peakpaare sowie die Retentionszeit des letzten Peaks im Chromatogramm tRmax zur Minimierung der Analysenzeit. Diese Minimierung der Analysenzeit von Routinemethoden bietet ein erhebliches Potenzial zur nachhaltigen Chromatographie im HPLC-Analysenlabor.

Empirisches Multi-Faktor-/Multi-Zielgrößen-Modell

Tab. 1: Signifikante Faktoren und deren Stufen für eine nachhaltige HPLC-Trennoptimierung
Tab. 1: Signifikante Faktoren und deren Stufen für eine nachhaltige HPLC-Trennoptimierung
(Bild: Bilke)

Tab. 2: Zielgrößen Rs und tRmax sowie deren Kriterien für eine nachhaltige HPLC-Trennoptimierung in Abhängigkeit von der Wahl des organischen Lösungsmittels
Tab. 2: Zielgrößen Rs und tRmax sowie deren Kriterien für eine nachhaltige HPLC-Trennoptimierung in Abhängigkeit von der Wahl des organischen Lösungsmittels
(Bild: Bilke)

Eine signifikante Zwei-Faktor-Wechselwirkung AB bedeutet, dass der Effekt des Faktors A auf die betrachtete Zielgröße vom Wert (Stufe) des Faktors B abhängt und umgekehrt, d.h. dass sich A und B sich in ihrer Wirkung auf die Zielgröße gegenseitig beeinflussen, also verstärken oder abschwächen. Da die Schätzung von Wechselwirkungen zwischen den Einflussgrößen und ihr Einfluss auf die Zielgrößen beim Optimieren einer HPLC-Trennung sehr wichtig ist, wurde hier ein Rechtschaffner-Versuchsplan mit 37 Versuchen zur empirischen Beschreibung von Ursache (Einflussgrößen) und Wirkung (Zielgrößen) der simultanen Optimierung von sieben Einflussgrößen (s. Tab. 1) mit zwölf Zielgrößen (s. Tab. 2) verwendet.

Im Folgendem wird die nachhaltige Trennungsoptimierung der HPLC-Methode in Abhängigkeit von den in der Pharma-HPLC wichtigsten Einflussgrößen wie Gradientenzeit tG, Temperatur T, Zusammensetzung organischer Eluent B tC(B2:B1), Startkonzentration Eluent B %Bs, Endkonzentration Eluent B %Be, pH wässriger Eluent A und Flussrate F der Eluenten mittels eines Multi-Faktor-/Multi-Zielgrößen-Modells (s. Abb. 1) vorgestellt.

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