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Optimierte HPLC

So gelingt die nachhaltige und robuste HPLC-Trennungsoptimierung

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Robuste Arbeitspunkte der HPLC-Trennungsoptimierung

Tab. 3: Robuster Arbeitspunkt und jeweilige Faktoreinflüsse der globalen Trennoptimierung in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des organischen Eluenten
Tab. 3: Robuster Arbeitspunkt und jeweilige Faktoreinflüsse der globalen Trennoptimierung in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des organischen Eluenten
(Bild: Bilke)

Im Folgendem wird nun die Güte der HPLC-Trennung in Abhängigkeit von der Wahl des organischen Lösungsmittels betrachtet. Die gefundenen robusten Arbeitspunkte (Punkt im Design Space, der in allen möglichen Raumrichtungen die größte Distanz zu den Spezifikationsgrenzen hat) sowie der Einfluss der Faktoren der globalen Trennoptimierung sind in der Tabelle 3 zusammengestellt.

Aus ihr ist zu entnehmen, dass je nach gewähltem Lösungsmittel als organischem Eluent immer unterschiedliche, robuste Arbeitspunkte im Design Space erhalten werden.

Auch der Einfluss des jeweiligen Faktors auf die HPLC-Trennung ist stark abhängig von der Zusammensetzung des Lösungsmittels. Den größten Einfluss auf die HPLC-Trennung weist der Faktor „Eluentzusammensetzung (B2:B1)“ mit 32% beim Einsatz von Acetonitril auf. Für das Lösungsmittelgemisch Acetonitril:Methanol (50Vol.%:50Vol.%) ist neben dem starken Einfluss der Faktoren „Gradientenzeit“ mit 24,3% und „Flussrate“ mit 21% der geringste Einfluss des Faktors „Startkonzentration Eluent B“ mit nur 5% auffallend.

Die berechneten Zielgrößen-Werte Rs und tRmax der Multi-Faktor-/Multi-Zielgrößen-Optimierung sind in Tabelle 4 aufgelistet.

Tab.4: Zielgrößen-Werte der globalen Trennoptimierung in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des organischen Eluenten
Tab.4: Zielgrößen-Werte der globalen Trennoptimierung in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des organischen Eluenten
(Bild: Bilke)

Wie die Werte für die Auflösung Rs zeigen, werden für das jeweilige kritische Peakpaar Rs-Werte ≥I2.6I erhalten. Eine selektive HPLC-Trennung wird somit beim Einsatz des jeweiligen Lösungsmittels im organischen Eluent erreicht. Die Zielgrößenspezifikationen -1,5 ≥ –Rs,krit. oder Rs,krit. ≥ 1,5 und tRmax ≤ 22 min werden sowohl für alle elf Peakpaare als auch für die Retentionszeit des letzten Peaks im Chromatogramm eingehalten.

Visualisierung des Design Space

Aussagen zur Robustheit der nachhaltigen Trennoptimierung können in Form der Grafiken als 2D-Design Space Hypercube und Design Space Range dargestellt werden. Die Abbildungen 2a-c in der Bildergalerie zeigen die Design-Space-Hypercube-Grafiken für die wichtigsten Faktoren pH und tG in Abhängigkeit von der Wahl des organischen Eluenten mit einer Fehlerwahrscheinlichkeit von 1%.

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Wie aus den Abbildungen 2a-c ableitbar, wird mit zunehmenden Austausch der Vol.% an Acetonitril gegen Methanol im organischen Eluenten die Fläche des Design Space Hypercube im experimentellen Bereich immer kleiner, belegbar mit den relativen Volumenwerten von 19.3%, 0.02% und 0.7%.

Für eine umweltfreundlichere chromatographische Trennung ist oft der Einsatz von superkritischem Kohlendioxid als Lösungsmittel empfehlenswert:

Das relative Volumen in der Design-Space-Berechnung ist die Auflösung (Anzahl diskreter Blöcke, in die die untersuchte Design Space Region unterteilt wird) hoch der Anzahl der Faktoren. Gut ist auch in diesen Abbildungen zu erkennen, dass bei Wahl von Acetonitril der größte robuste Hyperwürfel und damit die breitesten Faktorbereiche (Veränderungen der Faktoreinstellung innerhalb des Design Space unter Einhaltung der Zielgrößen-Spezifikationen) ausgewiesen werden. Je mehr Methanol im organischen Eluenten zum Einsatz kommt, desto kleiner ist der robuste Raum in dem man sich unter Einhaltung der Spezifikationen bewegen darf. Diese Tatsache ist in den aus den Design-Space-Hypercube-Grafiken (s. Abb. 3a-c in der Bildergalerie) ableitbaren Spezifikationsgrenzen der bewährten Faktorbereiche für jeden Faktor festgeschrieben.

Fazit: Alle Einflussgrößen sind relevant

Ein nachhaltiges und robustes Optimieren einer HPLC-Trennung ist nur realisierbar, wenn alle signifikanten Einflussgrößen simultan in die Betrachtung einbezogen werden. Die alleinige Änderung einzelner Einflussgrößen bei der Optimierung ist nicht zielführend und neben der Selektivität ist immer die Robustheit der HPLC-Trennung zu belegen.

* Dr. H.-W. Bilke: LC-Pharm-HPLC-Expert Service, 83098 Brannenburg

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