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Fluoreszenzmikroskopie

Superauflösende Fluoreszenzmikroskopie zellulärer Strukturen

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In der Fluoreszenzmikroskopie gelingt dies mit optisch schaltbaren Farbstoffen: Bestrahlt man diese mit Licht einer geeigneten Wellenlänge, so werden, die meisten von ihnen ausgeschaltet (s. Abb. 3). Nur einige wenige Farbstoffe verbleiben in ihrem fluoreszierenden Zustand. Ihre Position wird exakt bestimmt, und auch sie werden mit Licht wieder ausgeschaltet, bevor der nächste Zyklus beginnt, in dem wieder einige andere Schalter statistisch durch Bestrahlung mit Licht einer anderen Wellenlänge in ihre fluoreszierende Form überführt werden. Zur exakten Positionsbestimmung einzelner fluoreszierender Schalter werden die Zentren der detektierten Punkt-abbildungsfunktionen (engl. point spread function, PSF) der einzelnen Farbstoffe mithilfe einer mathematischen Anpassung (2D-Gaußfunktion) in Abhängigkeit von der Photonenausbeute (Statistik) bestimmt. Damit wird die genaue Position der Farbstoffmoleküle bestimmt. Dieser Prozess der Lokalisation wird mehrere tausendmal wiederholt, und schließlich wird aus allen Koordinaten einzelner Moleküle ein Bild rekonstruiert (s. Abb. 3). Hierdurch kann man die Beugungsgrenze auf einfache Art und Weise mit kommerziell erhältlichen organischen Farbstoffen oder damit markierter Sonden umgehen und dSTORM-Bilder (direct stochastic optical reconstruction microscopy) mit einer optischen Auflösung von weniger als 20 Nanometern unter Routinebedingungen erhalten [1 – 3] (s. Abb. 4). Die Methode ist der photoactivated-localization microscopy (PALM) sehr ähnlich, bei der photoaktivierbare fluoreszierende Proteine verwendet werden [4]. Da die Farbstoffe reversibel schaltbar sind und die Schaltraten durch die Anregungsleistung einstellbar sind, können jedoch auch schnellere dynamische Prozesse verfolgt werden [5].

Anwendung: dSTORM in lebenden Zellen

Im Gegensatz zu einer Vielzahl unterschiedlicher photoaktivierbarer fluoreszierender Proteine standen bisher nur wenige optisch schaltbare organische Farbstoffe zur Verfügung. Angetrieben durch die große Bedeutung der super-aufgelösten Fluoreszenzmikroskopie für die Biologie und Medizin wurde die Methode weiterentwickelt, sodass es gelingt, die meisten kommerziell erhältlichen Fluoreszenzfarbstoffe als Photoschalter einzusetzen. Fluoresceine, Rhodamine und Oxazine können reversibel und hocheffizient zwischen einem fluoreszierenden „An-Zustand“ und einem nicht fluoreszierenden „Aus-Zustand“ durch Bestrahlung mit Licht von nur einer Wellenlänge und unter physiologischen Bedingungen geschalten werden (s. Abb. 5). Die Methode basiert darauf, dass sich die meisten im sichtbaren Spektralbereich absorbierenden und fluoreszierenden Farbstoffe in Gegenwart millimolarer Konzentrationen reduzierender Thiolverbindungen wie Mercaptoethylamin (Cysteamin) oder Dithiothereitol (DTT) durch einen licht-induzierten Prozess in einen sehr stabilen Aus-Zustand überführen lassen. Der An-Zustand wird durch Oxidation mit molekularem Sauerstoff (der in einer Konzentration von ca. 250 µM bei Raumtemperatur in Wasser gelöst ist) wieder bevölkert. Die einfache Erzeugung und Stabilität des Aus-Zustandes ist für die Methode von ausschlaggebender Bedeutung, da es nur so gelingt, dass die Mehrzahl der Farbstoffe zu jeder Zeit im Aus-Zustand verweilt und nur so eine Subpopulation weniger einzelner Farbstoffe „aktiv“ (im An-Zustand) ist. Ein entscheidender Vorteil der Methode liegt in der Tatsache, dass Zellen ebenso ein antioxidatives Schutzsystem basierend auf Glutathion (ein thiolhaltiges Reduktionsmittel) und einigen Enzymen besitzen. Somit können die meisten Fluoreszenzfarbstoffe unter zellulären Bedingungen ebenso für die superauflösende Mikroskopie nach dem hier vorgestellten Prinzip eingesetzt werden [3]. Die Methode erlaubt es, auf einfache Art und Weise superaufgelöste Fluoreszenzbilder mit konventionellen Farbstoffen im sichtbaren Bereich von ca. 480 – 700 nm unter physiologischen Bedingungen zu erzeugen. Andererseits kann dSTORM an jedem Standard-Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop zur Beobachtung selbst lebender Zellen mit einer Auflösung von etwa 20 Nanometer realisiert werden [3]. Methoden der Superauflösung werden bereits von verschiedenen Anbietern kommerzialisiert. Verbesserungen in der räumlichen und zeitlichen Auflösung sowie eine Erweiterung zur vorgestellten Methode werden derzeit entwickelt und erlauben damit in naher Zukunft die superaufgelöste Verfolgung der Dynamik zellulärer Strukturen.?

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Literatur

[1] Heilemann, M., S. van de Linde, M. Schüttpelz, R. Kasper, B. Sefeldt, A. Mukherjee, P. Tinnefeld, and M. Sauer, Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew. Chem. Int. Ed., 2008. 47: p. 6266-71.

[2] Heilemann, M., P. Dedecker, J. Hofkens, and M. Sauer, Photoswitches: key molecules for subdiffraction-resolution fluorescence imaging and molecular quantification. Laser & Photonics Reviews, 2009. 3: p. 180-202.

[3] Heilemann, M., S. van de Linde, A. Mukherjee, and M. Sauer, Super-resolution imaging with small organic fluorophores, Angew. Chem. Int. Ed., 2009. 48: p. 6903-8.

[4] Betzig, E., G.H. Patterson, R. Sougrat, O.W. Lindwasser, S. Olenych, J.S. Bonifacino, M.W. Davidson, J. Lippincott-Schwartz, and H.F. Hess, Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution, Science, 2006. 313; p. 1642-45.

[5] Endesfelder, U., S. van de Linde, S. Wolter, M. Sauer, and M. Heilemann, Subdiffraction-resolution fluorescence microscopy of myosin-actin motility, ChemPhysChem, 2010. 11: p.8836-40.

*Lehrstuhl für Angewandte Laserphysik & Laserspektroskopie, Universität Bielefeld, 33615 Bielefeleld

**Lehrstuhl für Biotechnologie & Biophysik, Biozentrum, Julius-Maximilians-Universität Würzburg, 97074 Würzburg

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