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Fluoreszenzmikroskopie

Superauflösende Fluoreszenzmikroskopie zellulärer Strukturen

| Autor/ Redakteur: Mike Heilemann* und Markus Sauer** / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Die Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht faszinierende Einblicke in die Organisation und Struktur lebender Zellen und Zellverbände. Aufgrund der Wellennatur des Lichts ist die Auflösung jedoch auf einige hundert Nanometer beschränkt. Eine neue Methode erlaubt es nun, zelluläre Strukturen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu beobachten.

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Die Fluoreszenzmikroskopie wird bereits seit vielen Jahren in der Biologie und Medizin zur Visualisierung und zum Studium der Interaktionen zellulärer Bestandteile und Strukturen erfolgreich eingesetzt. Hierbei werden die einzelnen Zellbestandteile, meistens Proteine, selektiv mit fluoreszenzmarkierten Liganden (z.B. Phalloidin für Aktin), Antikörpern (Immunfluoreszenz) oder durch Fusion mit einem fluoreszierenden Protein markiert. In fluoreszenzmikroskopischen Bildern lässt sich anschließend die Position oder die Bewegung der Signale im Cytoplasma oder im Nukleus bestimmen. Heute existiert eine breite Palette an Fluoreszenzfarbstoffen, Markierungsmethoden und Mikroskopiemethoden, deren Auflösung jedoch aufgrund der Beugung der Lichtwellen auf etwa die Hälfte der Wellenlänge des verwendeten Lichts, d.h. typischerweise auf ca. 200 bis 300 Nanometer, beschränkt ist. Hierdurch gehen wichtige Details, die für das Verständnis zellulärer Prozesse von ausschlaggebender Bedeutung sind, verloren. Einblicke in die Zusammensetzung lebenswichtiger molekularer Proteinkomplexe mit einer Größe von wenigen zehn Nanometern, d.h. mit einer Größe weit unterhalb der Beugungsgrenze, bleiben allerdings verwehrt.

Zur Überwindung der Auflösungsgrenze kann man sich eines einfachen Tricks bedienen: die präzise Bestimmung der exakten Position einzelner Farbstoffmoleküle. Ein Fluoreszenzmikroskop sammelt das Fluoreszenzlicht der Farbstoffe und bildet das Signal als Lichtfleck auf einem Detektor ab (s. Abb. 1). Hierbei wird das Signal selbst eines einzelnen leuchtenden Moleküls mit einer Größe von wenigen Nanometern aufgrund der Beugung in einem Lichtfleck mit einer Größe von einigen hundert Nanometern (entsprechend etwa der hal-ben Wellenlänge λ des Lichts) abgebildet (s. Abb. 2). Wenn die gemessene Abbildungsfunktion von einem einzelnen Farbstoff stammt, kann sie mithilfe einer Gaußfunktion angepasst und die genaue Position des Moleküls aus der Funktion bestimmt werden (s. Abb. 2). Die Genauigkeit hängt hauptsächlich von der Signalintensität ab, d.h. der Zahl der detektierten Photonen, und gelingt unter Standardbedingungen mit einem Fehler von wenigen Nanometern. Mit diesem Trick ist es möglich, die Position eines einzelnen Moleküls auf wenige Nanometer genau zu bestimmen, auch wenn aufgrund der Beugung eine deutlich breitere Abbildungsfunktion beobachtet wird.

Kontrolle der Fluoreszenz einzelner Farbstoffmoleküle

Befinden sich nun zwei oder mehr Farbstoffmoleküle in einem Abstand, der kleiner als die Auflösungsgrenze von λ/2 ist, so überlappen ihre Punktabbildungsfunktionen und können nicht mehr getrennt angepasst werden. In dem verschwommenen Bild geht ein erheblicher Teil der Strukturinformation verloren. Eine Erhöhung der räumlichen Auflösung gelingt in diesem Fall, wenn die Fluoreszenzfarbstoffe, die in ihrer Gesamtheit ein Bild darstellen, nicht gleichzeitig sondern zeitlich getrennt leuchten und ihre genaue Position so individuell bestimmt werden kann. Dabei muss darauf geachtet werden, dass gleichzeitig nur Farbstoffe fluoreszieren, die weiter als das Beugungslimit (~ λ/2) voneinander entfernt sind und somit als einzelne Moleküle erkannt werden können.

Ein anschauliches Beispiel: Wenn man eine Metropole wie London bei Nacht aus der Raumstation ISS betrachtet, erscheint die Stadt als leuchtender verschwommener Fleck. Die einzelnen Straßenzüge, Plätze und Gebäude können nicht mehr aufgelöst werden, weil die Abbildungsfunktionen der verschiedenen Signale in der Bildebene der Kamera oder des Auges in einer Entfernung von ca. 350 km überlappen. Einer ähnlichen Situation steht man bei der Fluoreszenzmikroskopie zellulärer Strukturen gegenüber. Würde jede Lichtquelle in London einzeln und für eine kurze Zeit angeschaltet, so könnte die Position jeder Lichtquelle aus der Punktabbildungsfunktion genau bestimmt werden. Nachdem alle Lichtsignale lokalisiert wurden, kann ein genaueres Bild der räumlichen Anordnungen der Lichtsignale und damit der Straßenzüge, Plätze und Gebäude etc. rekonstruiert werden, als es möglich wäre, wenn alle gleichzeitig leuchten. Der Prozess des An- und Ausschaltens sowie der exakten Lokalisation der Lichtsignale muss sehr schnell erfolgen, da ansonsten das rekonstruierte Bild aufgrund der Geschwindigkeit der ISS verwaschen wird.

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