TOC/TNb-Analyse misst Proteingehalt pharmazeutischer Produkte

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Analytik Jena GmbH&Co. KG

Nach der seit etwa 15 Jahren bestehenden DIN EN 12260 zur Bestimmung des gesamten gebundenen Stickstoffs (TN_b) in Wasserproben müssen für den Probenaufschluss Verbrennungstemperaturen größer 700°C in Gegenwart eines Katalysators gewährleistet werden. Bei diesem so genannten thermokatalytischen Aufschluss der Probe entstehen aus den in der Probe enthaltenen Stickstoffverbindungen überwiegend Stickstoffmonoxid und in kleineren Teilen höher oxidierte Stickstoffverbindungen. Über den anliegenden Trägergasfluss wird das entstandene NO zu einem Chemolumineszenzdetektor (CLD) befördert. Dort findet zunächst eine Reaktion der NO-Moleküle mit im CLD erzeugtem Ozon statt, wodurch energetisch angeregte NO₂-Moleküle gebildet werden. Entsprechend des veranschaulichten Reaktionsschemas gehen diese angeregten NO₂-Moleküle unter Abgabe der Lumineszenzstrahlung, welche über einen Photomultiplier detektiert wird, wieder in NO₂ im Grundzustand über. Diese Methode ist geeignet, jegliche stickstoffhaltige Verbindung zu erfassen, nicht jedoch molekularen Stickstoff (N₂). Das heißt jedoch, die Anwesenheit anorganischer Stickstoffverbindungen sowie organischer nicht-proteinogener Stickstoffverbindungen kann sich bei der Nutzung dieser Methode zur Proteingehaltsbestimmung als störend erweisen. Diese Gesamtstickstoffmethode besticht jedoch durch den Wegfall jeglicher Probenvorbereitung sowie durch äußerst kurze Messzeiten von lediglich 3 bis 5 min je Probeninjektion.

TN_b-Messung in Impfstoffen

Mit dem Multi N/C 2100 S von Analytik Jena (s. Abb. 2) lassen sich Proteingehalte effizient und automatisiert in jeglichen flüssigen Matrizes bestimmen. Zusätzlich können noch weitere Parameter, wie der TOC, TIC oder TC gemessen werden.

Der Multi N/C 2100 S ist ein TOC/TN_b-Analysator, der nach dem Prinzip der Direktinjektion der Flüssigprobe in ein mit Katalysator gefülltes Quarzglasverbrennungsrohr arbeitet. Durch Einsatz unterschiedlicher Injektionsspritzen der Größen 100, 250 oder 500 µl in Verbindung mit unterschiedlichen Autosampler-Racks für 2-ml- oder auch 8-ml-Vials lässt sich die Probenaufgabe am Multi N/C 2100 S optimal an die applikativen Erfordernisse anpassen. Auch partikelhaltige Suspensionen lassen sich durch den Einsatz von Kanülen mit großem Innendurchmesser sowie die standardmäßige Probenhomogenisierung über einen Magnetrührer am Sampler repräsentativ messen. Durch das Prinzip der septumfreien Injektion werden an diesem Analysengerät unabhängig vom Kanülendurchmesser der verwendeten Spritze hoch reproduzierbare Messergebnisse erreicht. Gearbeitet wird üblicherweise bei einer Verbrennungstemperatur von 800°C in Gegenwart eines Platinkatalysators und unter Verwendung von synthetischer Luft als Trägergas.

Der Analysator bietet mit einem Messbereich von 0,1 bis 200 µg/ml TN und eine Messempfindlichkeit vergleichbar mit dem empfindlichsten Protein-Test nach der BCA-Methode (0,2 bis 50 µg/ml Protein).

Der entscheidende Punkt bei diesem Messverfahren zur Proteinbestimmung ist die Kalibrierung des Verfahrens sowie die Umrechnung des erhaltenen Ergebnisses in Form des Gesamtstickstoffgehaltes in den Gesamtproteingehalt der Probe. Generell empfiehlt es sich immer, ein Verfahren matrixnah zu kalibrieren, d.h. bei einer TN-Bestimmung in proteinhaltigen Lösungen sollte auch zur Kalibrierung ein Proteinstandard verwendet werden. Dies stellt eine Abweichung zum nach Norm üblichen Vorgehen dar, wo eine Kalibrierung mittels Ammonium-/Nitrat-Mischstandard beschrieben wird.

Für die Durchführung der hier beschriebenen Stickstoffmessungen in Impfstoffen wurde das Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma Art.Nr. A-7906) mit einem spezifizierten Stickstoffgehalt von 15,87 % und einer Reinheit von größer 98 % verwendet. Für diesen BSA-Standard wurde ein Stickstoff-Umrechnungsfaktor von 6,30 errechnet.

Der in der Literatur häufig angegebene Faktor zur Umrechnung der Stickstoffkonzentration in die Proteinkonzentration liegt bei 6,25: Proteingehalt [mg/ml] = Stickstoff-Faktor (6,25) * TN-Gehalt [mg/ml].

In der durchgeführten Messserie wurden neben BSA-Lösungen als Kontrollstandard weiterhin als Referenzmaterial eine wässrige Lösung des Hyperimmunserum 1-3, Kanin 37 mit einer angegebenen IgG-Konzentration von 8,3 mg/ml verwendet (s. Abb. 3). Dies entspricht umgerechnet mit dem Stickstoff-Faktor für Proteine von 6,25 einem Stickstoff-Gehalt von 1,328 mg/ml. Eine entsprechende Verdünnung dieser Stammlösung wurde als unabhängiger Kontrollstandard gemessen.

In Tabelle 1 sind die Messergebnisse für mehrere untersuchte Impfstoffe zusammengefasst. Diese Ergebnisse wurden durch fünffach-Injektion von 200 µl unverdünnter Probe erhalten (s. Abb. 4).

Fazit: Durch den Einsatz eines TN_b-Analysators nach DIN EN 12260, beispielsweise des Multi N/C 2100 S von Analytik Jena, in der Proteinanalytik wird es möglich, die etablierten, meist arbeitsintensiven, wenig reproduzierbaren und störanfälligen Proteintestverfahren durch eine schnelle, zuverlässige und automatisierbare instrumentelle analytische Methode abzulösen. Diese Methode zeichnet sich durch einen großen linearen Messbereich, hohe Empfindlichkeit und Selektivität sowie den Wegfall von unnötigen Probenvorbereitungsschritten aus. Der Einfluss des Faktor Mensch auf die Analysenergebnisse wird hierbei deutlich minimiert.

Die Methode ist im europäischen Arzneibuch beschrieben und vergleichsweise einfach validierbar. Störeinflüsse wie anorganische Stickstoffsalze oder nicht proteinogene organische Stickstoffverbindungen, welche sich auch bei vielen Proteintests störend bemerkbar machen, lassen sich hier ebenso falls nötig durch eine Proteinausfällung und Abtrennung ausschließen. n

* *B. Bletzinger: Analytik Jena AG, 07745 Jena

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