Überprüfung der Peakreinheit

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Eine unbekannte Probe wird analysiert und es soll ein Fingerprint per HPLC erstellt werden, um für eine gleichmäßige Qualität zu sorgen.? Wie kann der Anwender sicher sein, dass die Peaks „sauber" sind?? Bei unbekannten Proben kann der Anwender nie ganz sicher sein, ob ein auftauchender Peak wirklich nur einer Substanz zugeordnet werden kann (vgl. HPLC-Tipps und Tricks LP 5/2007 „Peakindentifikation"). Allerdings kann man mit einer Reihe von Maßnahmen die Wahrscheinlichkeit der Reinheit eines Peaks signifikant erhöhen. ? Bewusst soll an dieser Stelle nicht auf die aufwändigen modernen Kopplungstechniken wie HPLC-MS oder HPLC-NMR eingegangen werden, da hier erheblicher apparativer Aufwand nötig ist. ? Als Erstes muss sichergestellt werden, ob überhaupt alle vorkommenden relevanten Substanzen unter den angewandten chromatographischen Bedingungen gesehen werden können. Hier stellt sich die Frage nach der Detektionswellenlänge, da in der sehr verbreiteten UV-Detektion selektiv (wellenlängenabhängig) detektiert wird. Am einfachsten ist hier die Überprüfung durch die Injektion bei einer anderen Wellenlänge. Hat man z.B. die häufig eingesetzte Wellenlänge 254 Nanometer beim ersten Injekt gewählt, so sollte nun möglichst kurzwellig gearbeitet werden. Wenn es die Eigenabsorption (UV-cut-off) des Elutionsmittels erlaubt, wäre hier z.B. die Messung bei 210 Nanometer eine Möglichkeit, da man im Allgemeinen im kurzwelligen Bereich universeller detektieren kann. Bei Einsatz eines Diodenarraydetektors liegen natürlich alle Informationen gleichzeitig an, sodass auf eine zusätzliche Injektion verzichtet werden kann. ? Selbst wenn nun die Chromatogramme identisch sind, ist das noch kein endgültiger Beweis, dass die Peaks wirklich rein sind, denn aliphatische Substanzen wie Zucker oder viele Aminosäuren sieht man auch jetzt noch nicht. Hier sollte man, isokratische Trennung vorausgesetzt, den Einsatz eines anderen Detektors, z.B. eines RI-(Brechungsindex-)Detektors erwägen. Dieser Detektor ist zwar weniger empfindlich und nicht gradiententauglich, kann aber viel universeller eingesetzt werden. Ist eine Gradientenelution für die Messung erforderlich, so bietet sich der Einsatz eines ELSD-Detektors (Lichtstreudetektor) an.? Zusätzliche Sicherheit gewinnt man bei der Trennung in einem anderen chromatographischen System. Dabei kann die Säule beibehalten und der Eluent verändert werden, bei gepufferten Systemen kann z.B. ein anderer Puffer verwendet, eventuell sogar ein anderer pH-Wert gewählt werden oder statt Methanol/WasserAcetonitril/Wasser oder umgekehrt eingesetzt werden. Natürlich ist es auch möglich, die Säule auszutauschen und beispielsweise eine RP-18-Phase gegen eine RP-8-Phase oder sogar eine CN-Phase auszutauschen. Selbst der Einsatz des gleichen Säulentyps mit einer kleineren Korngröße (drei statt fünf Mikrometer) kann zusätzliche Erkenntnisse bringen.? ? Durch Änderung der chromatographischen Parameter erhält der Anwender zusätzliche Erkenntnisse über die Peakreinheit. ? Es ist sehr unwahrscheinlich, dass die Trennung unterschiedlicher Substanzen in verschiedenen chromatographischen Systemen das gleiche Ergebnis bringt. Unterschiedliche Chromatogramme bei den gleichen Bedingungen weisen auf unvollständige Trennungen hin.? ? Tel. +49 (0) 1 70 / 5 22 29 96

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