Überwachung der Fermentation in Echtzeit mit der PTR-MS

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Universität für Bodenkultur Wien Inst. f. angeandte Mikrobiologie

ACIB GmbH – Austrian Centre of Industrial Biotechnology

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Im Rahmen des Austrian Centre of Industrial Biotechnology (ACIB) wurde in Zusammenarbeit mit Ionimed Analytik und Betrieben der biopharmazeutischen Industrie die PTR-MS-basierte Methode zur Messung volatiler Komponenten in der Fermenterabluft implementiert. Diese Methode wird nun zur Charakterisierung von Bioprozessen eingesetzt und weiterentwickelt. Flüchtige, von Zellen ausgeschiedene Stoffwechselprodukte werden in der Abluft von Fermentationsprozessen kontinuierlich erfasst und in Bezug auf ihre Information zum Zellstoffwechsel interpretiert sowie im Zusammenhang zum Prozessverlauf betrachtet.

Geeignetes Interface

Ein zentraler Punkt der Arbeiten lag in der Entwicklung eines geeigneten Interfaces zwischen Messgerät und Bioreaktor (s. Abb. 1) welches die Prozessauflagen der Pharmaindustrie erfüllt und gleichzeitig die flüchtigen Stoffwechselprodukte schnell und quantitativ, also möglichst unverändert, zum Messgerät führt. Dieses Interface ist über einen Sterilfilter direkt mit dem Fermenter verbunden. Alle gasführenden Leitungen und Bereiche werden beheizt, um die Kondensation von Wasser zu verhindern. Zusätzlich verhindert ein Abscheider, dass potenziell gebildetes Kondensat in das PTR-MS-System eingetragen wird. Integriert sind darüber hinaus Ventile, die eine Verdünnung des Analysegases aus dem Fermenter sowie die Zufuhr von Kalibriergasen erlauben. Für alle Oberflächen der Probenahmeeinheit wurden inerte Materialien und Beschichtungen verwendet.

Die so gestaltete Einheit wurde bei drei identischen Kultivierungen mit rekombinanten Escherichia-coli-Bakterien eingesetzt und die im Prozessverlauf gebildeten flüchtigen Verbindungen mittels PTR-MS analysiert (s. Abb. 2). Die hohe Reproduzierbarkeit der Messungen zeigt, dass sich das entwickelte Interface für den Transport von flüchtigen Verbindungen aus dem Bioreaktor in das PTR-MS-Messgerät sehr gut eignet (s. Tabelle 1).

In der Fermenterabluft konnten mehr als 20 chemische Verbindungen gefunden werden, die einen charakteristischen Verlauf über die Fermentation aufwiesen. Ein Großteil der detektierten Moleküle sind Stoffwechselprodukte, die in unmittelbarem Zusammenhang mit verschiedenen Vorgängen in der Zelle stehen und damit bisher nicht in Echtzeit verfügbare biologische relevante Informationen enthalten. Weiters konnten auch Verbindungen gefunden werden, die der Prozessmatrix zugeordnet werden konnten.

Azetaldehyd als Hinweis

Zur Produktion rekombianter Proteine mit E. coli werden Fedbatch-Verfahren verwendet, die in der Medienzulaufphase eine Kontrolle der Wachstumsrate erlauben [2]. Mithilfe chemischer Substanzen wird zu einem Zeitpunkt, zu dem die Kultur schon eine gewisse Zelldichte erreicht hat, die Produktion des rekombinanten Proteins eingeschaltet. Die Synthese des gewünschten Proteins belastet den Zellstoffwechsel und löst Stressreaktionen und Wachstumsstörung aus. Durch verändertes Wachstumsverhalten sind die Zellen nicht mehr in der Lage, die über den Zulauf zugeführte Glukose in Biomasse umzuwandeln. Sie aktivieren beispielsweise Reaktionswege die überschüssige Glukose nicht zu Biomasse sondern zu kleineren Metaboliten verstoffwechseln. Eines dieser Produkte ist Azetat, welches, in größerer Menge vorkommend, das Zellwachstum limitiert. Es ist bekannt, dass Azetaldehyd (m/z 45) im „mixed acid fermentation“ genannten Stoffwechselweg entsteht. Azetaldehyd wird in der Batchphase, wo Glukose im Überschuss vorhanden ist, gebildet und die Konzentration im Abluftstrom steigt mit Zunahme der Biomasse an. Sobald die im Batch vorgelegte Glukose verbraucht ist, wird der Medienzulauf gestartet. In dieser Phase wird kein Azetaldehyd gebildet und das vorhandene wird über die Abluft aus dem Fermenter transportiert. Durch dieses „Ausgasen“ sinkt die Konzentration in der Abluft wieder ab, steigt jedoch zu einem späteren Zeitpunkt wieder stark an. (s. Abb. 3A). Dieser erneute Anstieg im Azetaldehydspiegel fällt mit dem Zeitpunkt der Überlastung der Zellen durch die rekombinante Proteinproduktion zusammen (s. Abb. 3B). Azetaldehyd kann daher in diesem Prozess als empfindlicher Marker für Zellüberlastung durch rekombinante Proteinproduktion verwendet werden.

Ausblick

Durch Weiterentwicklung der Methode sollen auch nicht direkt messbare Größen wie die Produktmenge in Echtzeit zugänglich gemacht werden. In einem weiteren Ansatz sollen alle gefundenen volatilen Verbindungen bzgl. Herkunft im Stoffwechsel und Auswirkung auf Prozess und Zellphysiologie analysiert werden. Geplant ist der Einsatz der Technik im industriellen Umfeld der GMP-Produktion.

Dieser Artikel entspricht inhaltlich den Erkenntnissen der Originalpublikation (Siehe Literaturverzeichnis [1]) - “This material is reproduced with permission of John Wiley & Sons, Inc.”

Literatur

[1] Originalpublikation: Luchner M, Gutmann R, Bayer K et al. Implementation of proton transfer reaction-mass spectrometry (PTR-MS) for advanced bioprocess monitoring. Biotechnol Bioeng, doi:10.1002/bit.24579, 109(12), 3059-3069 (2012)

[2] Cserjan-Puschmann M, Grabherr R, Striedner G, Clementschitsch F, Bayer K. Optimizing Recombinant Microbial Fermentation Processes. BioPharm, July, 26-34 (2002).

* Dr. R. Gutmann: ACIB GmbH, 6020 Innsbruck/Österreich

* *Dr. J. Herbig: Ionimed Analytik GmbH, 6020 Innsbruck/Österreich

* **Dr. M. Luchner und Dr. G. Striedner: Universität für Bodenkultur Wien, Department für Biotechnologie, 1190 Wien/Österreich

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