Verbesserte Methode zur Erzeugung virusfreier humaner iPS-Zellen

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Die Transfektion der humanen Vorhautzellen (HFFs) erfolgte entweder alleine mit einem Kontroll-RNA-Replikon, das ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) kodiert (s. Abb. 2A) oder mit der Simplicon Reprogramming RNA (s. Abb. 2B). Zur Beurteilung der Transfektionseffizienz wurden die Zellen am darauf folgenden Tag analysiert. Ein hoher Prozentsatz der Zellen in Abbildung 2A zeigte ein GFP-Signal; die Transfektion der HFFs unter Verwendung von Simplicon Reprogramming RNA führte einen Tag nach der Transfektion bei etwa 5-10 % zur Expression von Oct-4 (grün, s. Abb. 2B). Um die Kinetik der Reprogrammierung zu beurteilen, wurden die mit Simplicon transfizierten HFFs zu vier verschiedenen Zeitpunkten mittels Hellfeldmikroskopie analysiert (s. Abb. 3). Kolonien humaner iPS-Zellen zeigten sich zwischen Tag 17 und 21, nach einer einzigen Transfektion an Tag Eins.

Die mit Simplicon reprogrammierten Fibroblasten wurden 28 Tage nach der Transfektion auf die Aktivität der alkalischen Phosphatase (AP), einem Marker für Pluripotenz, untersucht (Abb. 4). Sowohl die HFF- als auch die BJ-Fibroblasten wiesen einen hohen Grad an AP-Aktivität auf, wobei die HFF-Zellen das intensivste Signal zeigten.

Reproduzierbarkeit

Um die Leistung der verschiedenen Chargen der synthetischen Simplicon RNA-Stränge zu vergleichen, wurden für die Transfektion der HFFs vier unterschiedliche Chargen verwendet, wobei 10 000 Zellen pro Transfektion verwendet wurden. Anschließend wurde die Anzahl der hiPS-Zellkolonien gezählt, die 17 bis 21 Tage später gewachsen waren. Zur Berechnung der Reprogrammierungseffizienz wurde die Anzahl reprogrammierter Kolonien durch die Anzahl der Originalzellen dividiert. Wie wir feststellten, zeigten alle Produktionschargen eine ähnliche Reprogrammierungseffizienz, und zwar im Bereich von 0,5-1 %.

Schlussfolgerung

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieser RNA-basierte Ansatz der Simplicon RNA-Reprogrammierungstechnologie ein breites Anwendungsgebiet für effiziente Generationen von humanen iPS-Zellen bietet. Die Technik kann bei Studien mit Krankheitsmodellen, in der Transdifferenzierungsforschung sowie bei humanen Zelltherapien und in der regenerativen Medizin eingesetzt werden.

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