Verbesserte Methode zur Erzeugung virusfreier humaner iPS-Zellen

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Die RNA-Reprogrammierungstechnologie Simplicon von Merck Millipore ist ein neues Reprogrammierungssystem, das ein einziges synthetisches, polycistronisches, selbstreplizierendes RNA-Replikon verwendet, das speziell dafür entwickelt wurde, um bei der Erzeugung humaner iPS-Zellen die zelluläre RNA nachzuahmen [3]. Der RNA-Einzelstrang enthält vier Reprogrammierungsfaktoren, nämlich OCT-4, KLF-4, SOX-2 und GLIS1, und ermöglicht eine effiziente Reprogrammierung unter Verwendung eines einzigen Transfektionsschrittes ohne jegliche virale Zwischenprodukte oder Wirtsgenomintegration.

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Sobald die iPS-Zellen hergestellt sind, kann die RNA einfach und selektiv eliminiert werden, indem der Interferon-gamma (IFNg)-Inhibitor B18R aus dem Zellkulturmedium entfernt wird. Das Ergebnis sind transgenfreie, replikonfreie iPS-Zellen.

Erzeugung humaner iPS-Zellen

Zuerst werden 4 x 10⁵ humane Vorhautfibroblasten (HFFs) in jede Vertiefung einer 6-Well-Zellkulturplatte mit einem gering serumhaltigen Fibroblastenmedium plattiert, sodass sie sich über Nacht anhaften können. Die HFFs wurden davor 2 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO₂ mit dem B18R-Wachstumsfaktor behandelt. Danach erfolgte die Transfektion der HFFs mit 1 μg des Simplicon VEE-OKS-iG und B18r-RNA in 2,5 μl des mit Opti-MEM-Medium (Life Technologies) nach Herstellerangaben verdünnten Transfektionsreagens Lipofectamine 2000. Die Mischung aus Simplicon RNA und Transfektionsagens wurde während 3 Stunden bei 37 ˚C und 5 % CO₂ inkubiert. Nach der Transfektion mit RNA wurde das Medium gegen 2 ml/Well ADMEM-Medium mit 10 % fetalem Kälberserum (FBS), 1 % Glutamax-Zusatz und B18R-Protein (200 ng/ml) ausgetauscht.

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Ab dem Tag nach der Transfektion wurden die Zellen täglich während eines Zeitraums von insgesamt zehn Tagen mit ADMEM plus 10 % FBS, 1 % Glutamax-Zusatz, B18R-Protein und 0,5 μg/ml Puromycin ernährt. Ab Tag 4 bis 5 war bei 30-60 % der Zellen der Zelltod zu beobachten, und die Puromycin-resistenten Zellen begannen an Tag 7 bis 9 nach Puromycinselektion zurückzuwachsen. An Tag 10 wurden etwa 5 x 10⁴ bis 1 x 10⁵ reprogrammierte Zellen neu ausplattiert, und zwar auf frischen primären murinen embryonalen Fibroblasten von Embryomax in MEF-konditioniertem Medium mit B18R-Protein (200 ng/ml) und dem Zusatz von kleinen Molekülen mit Human iPS Reprogramming Boost Supplement II. Die Zellmorphologie wurde täglich kontrolliert. Kleine iPS-Zellkolonien begannen etwa ab Tag 15 bis 16 zu wachsen. An Tag 20 wurden die reprogrammierten Zellen auf ein Standardmedium für humane embryonale Stammzellen ohne B18R-Protein überführt, und die Kolonien wurden auf der Basis der Koloniemorphologie selektiert und für weitere Experimente expandiert.

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