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HPLC

Wie setzt man die Mischkammer in der HPLC ein?

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Leider beißen sich gerade diese beiden Anforderungen ein wenig. Ein großes Volumen der Kammer garantiert eine gute Durchmischung, denn die Flüssigkeiten haben mehr Zeit sich zu treffen. Dafür geht allerdings die Präzision des Mischverhältnis verloren. Der Gradientenverlauf wird „unschärfer“. Das kann man an einem Stufengradienten sehr schön nachvollziehen. Hier wäre der Umstieg auf eine kleine Mischkammer angebracht.

Je geringer die Flussrate, desto kleiner muss das Mischkammervolumen sein. Ideal wäre also eine dynamisch verstellbare Kammer, die der jeweiligen Flussrate folgt. Die Firma LKB hatte so etwas ähnliches vor vielen Jahren an ihren Pumpen: Ein Glasrohr mit einem festen und einem verstellbaren Kolben. Dazwischen rotierte ein senkrecht stehender Rührfisch. Es hat sehr gut funktioniert, konnte sich aber nicht wirklich durchsetzen.

Aber bei statischen Mischkammern sind durchaus Kompromisse möglich: Bei Flussraten von 500 μl/min bis 2 ml/min für eine analytischen Kammer kommt man recht gut hin. Diese hat dann ein Volumen von ca. 300 bis 350 μl, was ausreichende Präzision des Gradienten bei niedrigem Rauschen garantiert; Ob statisch oder passiv gemischt, ist hier egal.

Wie sieht es bei Mikro-HPLC aus?

Für die Mikro-HPLC mit Flussraten um 50 oder 100 μl/min sind natürlich deutlich kleinere Kammern erforderlich. Dafür braucht es für präparative Anwendungen nicht unbedingt eine besonders große Kammer, da der sehr präzise Gradientenverlauf mit einer unruhigen Basislinie erkauft wird. Allerdings ist das bei Peaks, die man nicht auswerten, sondern nur sammeln will, ziemlich egal.

Um nochmal auf den Unterschied von hoch- und niederdruckseitige Gradientenformung zurück zu kommen: Bei der niederdruckseitigen Gradientenformung haben wir es mit kleinen, von den Magnetventilen vor der Pumpe erzeugten Flüssigkeitssegmenten zu tun, die vermischt werden müssen. Grundsätzlich gibt es keinen Unterschied zwischen den Mischern, nur muss das Kammervolumen bei der Niederdruckmischung mindestens ein dreifaches des kleinsten Flüssigkeitssegmentes betragen, das von den Magnetventilen während der Saugphase erzeugt werden kann. Bei mit Kugeln gefüllten Mischern ist die Berechnung des freien Volumens nicht ganz einfach, da es für die Packungsdichte von Kugeln nur eine Annäherung, aber keinen mathematischen Beweis gibt. Die „Kepler'sche Vermutung“ besagt, dass die mittlere Packungsdichte von gleichförmigen Kugeln maximal 74% beträgt, experimentell kommt man auf 65%. Bei einem gegebenen Gesamtvolumen einer Kammer von 1 000 µl wären also 350 µl Mischvolumen anzusetzen. Der Rest des Raumes wird von den Kugeln besetzt.

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