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HPLC Wie setzt man die Mischkammer in der HPLC ein?

| Autor/ Redakteur: Werner Röpke* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Viele Trennprobleme in der HPLC können nur durch die Gradientenelution gelöst werden. Um hier reproduzierbare Gradienten zu erzeugen, müssen Mischkammern eingesetzt werden. Welche Unterschiede gibt es bei den Mischkammern und worauf muss der Anwender achten?

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Abb.1: In der so genannten Mischkammer werden die beiden Lösemittel für die Gradienten-HPLC gemischt.
Abb.1: In der so genannten Mischkammer werden die beiden Lösemittel für die Gradienten-HPLC gemischt.
(Bilder: Techlab)

Mit dem Aufkommen der Gradientenelution in der HPLC-Analytik bestand die Notwendigkeit, zwei unterschiedliche Flüssigkeitsströme innig zu vermischen, bevor sie ihren Weg in der HPLC fortsetzen. Das Wesen der Gradientenelution bestand und besteht darin, die Elutionskraft des Laufmittels langsam im Laufe der Trennung zu erhöhen.

Bei zwei Pumpen ist das noch vergleichsweise einfach. Der Anwender lässt einfach eine Pumpe schneller und die andere langsamer laufen und verändert so die Geschwindigkeiten während des Laufes kontinuierlich, das so genannte Hochdruckgradientensystem.

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Etwas problematischer wird es, wenn die Eluenten häppchenweise zugeteilt werden, wie es bei einem Niederdruckgradienten geschieht. Dabei handelt es sich natürlich auch um Hochdruckpumpen, doch die zwei, drei oder vier Laufmittel werden vor der Pumpe, also auf der Niederdruckseite, zugeführt. Aus diesem Grund hat sich dieser Name eingebürgert. Während der Saugphase der Pumpe schalten Magnetventile jeweils eine der bis zu vier Zuleitungen frei und formen auf diese Weise über die Laufzeit der Trennung ein Gradientenprofil.

Passive und aktive HPLC-Mischkammern

Die Ausgänge der beiden Pumpen bei Hochdruckgradientensystemen (schon aus Kostengründen keine drei oder gar vier) werden zusammengeführt. Im einfachsten Fall ist das ein T-Stück, in welchem sich dann Laufmittel A mit Laufmittel B irgendwie verquirlt und am Ausgang als einigermaßen homogenes Gemisch entlassen wird. Da aber bedingt durch winzige Druckschwankungen der Pumpen die hydraulischen Verhältnisse im T-Stück immer etwas instabil sind, schwankt auch die Mischung geringfügig in ihrer Zusammensetzung. Im besten Fall erhöht dies das Signal/Rauschen-Verhältnis der Messung, schlimmstenfalls zeigt sich eine deutlich sichtbare Wellenlinie in der UV-Absorbtion.

Zur Lösung dieses Problems orientierte man sich an den in Laboren üblichen Magnetrührern, verkleinerte diese und versah sie mit einem druckfesten Gehäuse.

Diese so genannten aktiven Mischer haben sich bis heute bewährt. Abbildung 2 links zeigt den typischen Aufbau: In einem Edelstahlgehäuse rotiert ein PTFE-ummantelter Rührfisch. Seine Abmessungen in horizontaler Rotatation definieren gleichzeitig das kleinstmögliche Kammervolumen. Die Eluenten treten am Boden der Kammer seitwärts ein, werden durchgequirlt und steigen nach oben. Dort ist die Kammer natürlich mit einem druckfesten Deckel verschlossen und hat einen Kapillaranschluss für das austretende Laufmittel, das nun dem Injektionsventil zugeführt werden kann.

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