Wozu braucht man die PCR?

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? Was sind die thematischen Schwerpunkte Ihrer Arbeitsgruppe???Dr. Pfaffl: Unsere jetzigen Forschungs-schwerpunkte liegen darin, die Effekte von sekundären Pflanzeninhaltsstoffen und Lebensmitteln auf die Darmimmunologie sowie Darmmorphologie zu erforschen. Wir arbeiten neben der quantitativen Real-time-RT-PCR (qRT-PCR) mit modernsten molekularbiologischen Methoden, wie Histologie und Immunohistologie. Unsere Probanden sind in erster Linie Nutztiere wie Rind, Kalb und Schwein, aber wir machen auch umfangreiche Zellkulturstudien. In Zukunft wollen wir die physiologischen Vorgänge auch in einzelnen Zellen untersuchen, Stichwort „Single-cell-qRT-PCR“. Des Weiteren liegt der Forschungsschwerpunkt in der Optimierung der quantitativen Real-time-RT-PCR in der ganzen Breite der Anwendungen: Validierung der prä-analytischen Schritte, ?z.B. der RNA-Qualitätsmessungen, die Entwicklung neuer Quantifizierungsstrategien und verschiedener Softwareapplikationen (Relative Expression Software Tool - Rest). ?? ? Die Real-time-PCR ist eine sehr innovative Technologie. In welchen Bereichen wird sie vorrangig eingesetzt? Welche anderen Methoden wird sie ersetzen können???Dr. Pfaffl: Die Einsatzgebiete der Real-time-PCR sind sehr breit und finden heute in jedem molekularbiologisch orientierten Labor Anwendung. Die PCR ermöglicht uns kleinste Mengen an DNA zu amplifizieren, und die Real-time-PCR erlaubt uns darüber hinaus auch kleinste DNA-Mengen quantitativ zu erfassen. Der größte Gewinn liegt wohl in der enormen Sensitivität und in der Schnelligkeit der Methode. Im Extremfall können einzelne Moleküle (ein bis zehn DNA-Moleküle) detektiert werden, und ab etwa zehn bis 20 Molekülen pro Testansatz kann man sogar von einer reproduzierbaren Quantifizierung sprechen. Der lineare Messbereich geht maximal bis in den Bereich von 109 (Milliarden) DNA-Startmolekülen. Die meisten Anwendungen finden sich in der molekularen Diagnostik, Forensik, Lebensmittelkontrolle, Mikrobiologie und Virologie. Die Kombination der PCR mit einer vorgeschalteten reversen Transkription (RT) erweitern das Spektrum auf die quantitative Erfassung von RNA und die Erstellung von mRNA Expressionsprofilen. Dies stellt auch den Schwerpunkt unserer Arbeit dar. Aufwändige und semi-quantitative Hybridisierungsverfahren wie Northern-Blotting oder RNA-Protection-Assay (RPA) sind in der Zwischenzeit durch die voll quantitative Real-time-RT-PCR ersetzt worden.?? ? Wo liegen derzeit die größten Herausforderungen (Reproduzierbarkeit, Standardi-sierung, Vergleichbarkeit)???Dr. Pfaffl: Die größten Herausforderungen liegen heute nicht mehr in der Reproduzierbarkeit der PCR selbst, sie liegen im Optimierungs- und Standardisierungsbedarf vor und nach der eigentlichen PCR. Das meiste Potenzial verspricht die Optimierung der Probenaufbereitung und die Bestimmung der RNA-Integrität sowie die Post-PCR, die Verrechung der erhaltenen Real-time-PCR-Daten. Gerade in den Arbeitsschritten der Prä-Analytik verstecken sich die größten Fehlerquellen und diese führen zu ungenauen Ergebnissen sowie zu großen Variationen. Die Probennahme stellt in der medizinischen und veterinärmedizinischen Forschung fast immer ein Problem dar. Oft werden Proben vom Menschen oder Tieren mittels Biopsie entnommen. Auch ist die schnelle Lagerung in flüssigem Stickstoff oder RNA-stabilisierenden Agenzien nicht immer optimal gewährleistet. Im Weiteren haben die RNA-Lagerung sowie die Extraktionen aus Formalin-fixierten Geweben oder mittels Laserstrahl präparierten Zellen einen gewaltigen Einfluss auf die RNA-Quantität und -Qualität sowie auf die folgende quantitative Analytik. Außerdem ergeben sich in der Praxis große Schwankungen in der RNA-Quantität und -Integrität bei der Anwendung unterschiedlicher Extraktionsmethoden, die in Zukunft verbessert und vereinheitlicht werden müssen. Auch an der Effizienz der PCR innerhalb eines Zyklus und deren genauer Messung kann und muss gearbeitet werden. Am wichtigsten erscheint die exakte Bestimmung der PCR-Effizienz anhand einer einzelnen PCR-Kurve und in Folge die Korrektur der Effizienz über Berechnungsalgorithmen. Wir arbeiten daran und werden im Sommer eine neue Software präsentieren können.?? ? Wie beurteilen Sie das zukünftige Potenzial der Methode???Dr. Pfaffl: Das Potenzial der Methode wird gerade erst erkannt. So konnten wir auf dem qPCR-2007-Kongress im März beobachten, wie neue Applikationen in Kombination mit der Real-time-PCR entwickelt werden. Als Schlagworte fallen mir spontan die Hochdurchsatz-Verfahren auf (384 well-Applikationen oder Hochdurchsatz-PCR-Arrays), das „Expression-Profiling“ in einzelnen Zellen (Single-cell-qRT-PCR), sowie die vielfältigen RNAi-Applikationen mittels micro-RNA, siRNA oder saRNA. Das ermöglicht uns Wissenschaftlern völlig neue Einblicke in die Physiologie und die Regulation einzelner Zellen innerhalb eines Gewebeverbandes. Auch die Neuentwicklung der hochauflösenden Schmelzkurvenanalyse (HRM) in Anschluss an die PCR verspricht einen Durchbruch in der SNP-Analytik.?? ? Sie betreuen auch eine Webseite rund um die PCR (s. InfoClick). Welche Informationen kann der User dort finden???Dr. Pfaffl: Ich versuche als Editor dieser Homepage alle Aspekte der PCR als auch der Real-time-PCR kompakt zusammenzufassen und der qPCR-Community zur Verfügung zu stellen. Alle wichtigen Schlagworte und Anwendungsgebiete sind in Unterseiten gruppiert und in einem Inhaltsverzeichnis alphabetisch geordnet. Die Internetseite hat sich seit ihrer Gründung im März 2002 zum Standard-Portal und Nachschlagewerk der weltweiten Real-time-PCR-Community entwickelt und erfreut sich einer regen Nutzung sowohl aus der Forschung als auch der Industrie. Allein im letzten Jahr hat sich die Zahl der Besucher auf 40?000 pro Monat fast verdoppelt. Ich werde mich auch in Zukunft bemühen, die Inhalte der Seite so interessant und aktuell wie möglich zu halten und freue mich immer auf konstruktive Kritik aus allen Reihen.

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