Zellbiologie: Reproduzierbarkeit und Präzision auch bei schwierigen Zellzählungen

Bildgebende Zytometer Zellbiologie: Reproduzierbarkeit und Präzision auch bei schwierigen Zellzählungen

13.12.2017Autor / Redakteur: Dr. Christoph Enz* / Dr. Ilka Ottleben

Zählen, was zählt: Für zahlreiche Anwendungen in Medizin und Life Sciences ist die Bestimmung der Zellzahl einer Probe sowie die Beurteilung bestimmter Zelleigenschaften wie der Viabilität oder Morphologie essenziell. Bildgebende Zytometer können dabei zur entscheidenden Präzision und Reproduzierbarkeit der Zellzählungen verhelfen.

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Cenibra GmbH

DÜPERTHAL Sicherheitstechnik GmbH & Co. KG

Memmert GmbH + Co. KG

Abb. 1: Zellen sind vielgestaltig und ebenso die Matrizes, in denen sie zu bestimmen sind. Im Bild: Illustration einer mirkroskopischen Darstellung.
(Bild: ©Ivanc7 - stock.adobe.com)

Wie oft ist im zellbiologischen Laboralltag eigentlich eine schnelle und präzise Bestimmung der Zellzahl relevant? Genau genommen dauernd, oder? Dieser Frage sahen sich vor etwa einem Jahrzehnt Jean und Peter Li aus Boston gegenüber. Die beiden hatten ein damals ganz neues, aber eigentlich schlichtes Tool entwickelt: eine skalierte Hämocytometer-Kammer „zum Wegwerfen“, also aus Kunststoff und damit sehr günstig, um den eigentlichen Kostenfaktor Arbeitszeit zu minimieren, der aus dem wiederholten Waschen und zwangsläufigem Check der Sauberkeit erwuchs. Bei der Vorstellung dieser heute noch erhältlichen „disposable hemocytometer slides“ am NIH in Washington wurden sie dann mit einer weiteren Frage konfrontiert: ließe sich nicht diese Art der Zählung automatisieren? Denn in der manuellen Zählung stecke noch viel mehr Zeit und Arbeit, und außerdem könne man damit vielleicht die Variabilität bei der Zählung durch unterschiedliche Laboranten eingrenzen und damit eine viel bessere Reproduzierbarkeit erreichen?

Das war die Gründungsidee der Firma Nexcelom, denn Jean und Peter mit ihrem Background in Elektrotechnik und computergestützem Maschinenbau sahen das Potentzial und machten sich an die Arbeit. In der Zwischenzeit haben sie mit der Cellometer-Familie den Industriestandard für bildbasierte Zellzählung entwickelt und sorgen damit für einfache, schnelle und reproduzierbare Zellzählung. Und das vor allem auch dann, wenn es um komplexe Proben und empfindliche Zellen geht.

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Abb. 2: Das Cellometer Vision CBA bietet wartungsfrei und in kleinen Volumina präzise Zellzählungen auch für komplexe Zelltypen wie Hepatocyten oder Adipocyten und darüber hinaus Assays für den Zellzyklus oder Apoptose. Auf Wunsch lässt sich dieses Cellometer auch für GMP/GLP zertifizieren.

Abb. 3: Einfach und standardisiert ist die Bedienung aller Cellometer: 20 µl auf den Probenträger pipettieren, ins Gerät einführen, den entsprechenden Assay auswählen und starten. Nach kurzer Zeit liegt das präzise Ergebnis vor.

Zellzählung mit bildgebenden Zytometern

Grundsätzlich handelt es sich dabei um kleine, automatisierte und für den Zweck optimierte Mikroskope. Man könnte auch von bildgebenden Zytometern sprechen. Und der fundamentale Vorteil von Bildern ist ja deren Dokumentationsvermögen: Man legt nicht nur eine Zahl nieder, sondern kann jederzeit auf die archivierten Bilder der Zellen zurückgreifen, um z.B. die Plausibilität einer Zählung zu überprüfen, selbst wenn diese lange zurückliegt.

Zellen sind vielgestaltig und ebenso die Matrizes

Aber warum gleich eine ganze Familie von Cellometern? Nun ja, Zellen sind vielgestaltig und ebenso sind die Matrizes, in denen sie zu messen sind, ganz unterschiedlich beschaffen. Man denke nur an verhältnismäßig einfache Zählungen von recht homogenen Kulturzellen im Vergleich zu relativ stark verschmutzten PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear Cell; dt.: mononukleäre Zellen des peripheren Blutes) oder sogar Zählungen in Vollblut. Auch das Größenspektrum von sehr kleinen Blutplättchen oder Hefen bis zu „kräftigen“ Adipozyten bietet Herausforderungen. Schließlich sind die Anforderungen je nach Zertifizierung der Labors unterschiedlich und die Möglichkeit zur GLP-Zertifizierung erfordert einen anderen instrumentellen Aufwand als eine Messung im reinen Forschungsumfeld. Und schließlich ist die Zählung ja selten nur dies, sondern oft eben auch eine Quantifizierung der Viabilität, der Transfektionseffizienz oder sogar ein Assay zu Zellzyklus oder Apoptose.

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LP-Tipp – Manuelle Zellzählung

Die klassische manuelle Methode der Zellzählung erfolgt in einer Zählkammer auch Hämozytometer genannt, weil sie oft zur Bestimmung der Anzahl von Blutzellen zum Einsatz kommt. Die Grundplatte der Zählkammer besteht aus optischem Spezialglas und hat die Größe eines normalen Objektträgers für die Durchlichtmikroskopie, nämlich: 76 mm × 26 mm. In der Mitte der Grundfläche der Zählkammer befindet sich ein je nach Kammertyp unterschiedliches Liniennetz (Zählfläche, Zählnetz). Je nach Typ der auszuzählenden Teilchen wird eine bestimmte Anzahl Groß- oder Gruppenquadrate ausgezählt und daraus ein Mittelwert gebildet. Multipliziert man diesen Wert mit einem entsprechenden Faktor erhält man die Teilchenzahl pro Volumeneinheit. Die Bestimmung der Zellzahl in einer Zellkammer ist als manuelle Methode anfällig für Fehler durch z.B. Verdünnung, Volumen- und Pipettierfehler sowie die subjektive Definition und Bewertung einer Zelle. Die Vorbereitung und anschließende Reinigung der Zählkammer sind zeitaufwändig und häufig werden aus Zeitgründen nicht ausreichend viele Ereignisse ausgezählt.

Alle diese Anforderungen kann man natürlich mit einem einzigen entsprechend ausgestatteten Gerät adressieren (und es überrascht nicht, dass das Flaggschiff- Cellometer „Vision CBA“ auch all das bietet). Aber das ist natürlich wie immer im Leben auch eine Geldfrage, sodass für die meisten Labore je nach Anwendung auch die günstigen „Einsteigermodelle“ mit reiner Hellfeldoptik (i.d.R. für Zellkultur und eher homogene Proben) oder die mittleren Linien mit zusätzlicher Fluoreszenzoptik (für Primärproben) eine ausgezeichnete Wahl sind.

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