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LABORAUTOMATION SPECIAL

Autosampler in der Chromatographie

| Autor/ Redakteur: OLAF SPÖRKEL* / Marc Platthaus

Autosampler schließen eine wichtige Lücke in der Routineanalytik und spielen eine immer größere Rolle in der Chromatographie. Mittlerweile wird kaum noch eine chromatographische Anlage ohne Autosampler verkauft.

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Abb.1: der Smartline3900 ist ein Allroundsystem für unterschiedliche Applikationen in der Routineanalytik.
Abb.1: der Smartline3900 ist ein Allroundsystem für unterschiedliche Applikationen in der Routineanalytik.
( Archiv: Vogel Business Media )

Autosampler schließen eine wich-tige Lücke in der Routineanalytik. Sie automatisieren die Proben-aufgabe und je nach Ausstattung auch die Probenvorbereitung. Das Verdünnen, Mischen, Deri-vatisieren und die Möglichkeit zum Injizieren der Probe ohne manuellen Eingriff spielt beson-ders in der Chromatographie eine herausragende Rolle. Mittlerwei-le wird kaum noch eine chroma-tographische Anlage ohne Auto-sampler verkauft.Die Chromatographie ist ein unersetzliches Verfahren zur Präparation und analytischen Aufreinigung von Substanzen. Die HPLC, aber auch die GC, IC oder GPC gehören zu den Routinemethoden, die in der Qualitätskontrolle, Umwelt- und Lebensmittelanalytik, Pharmakogenetik oder der kombinatorischen Chemie vielseitige Anwendungsmöglichkeiten finden. Ein kritischer und zeitintensiver Schritt ist die Probenaufgabe. Die Injektion einer Probe kann manuell oder automatisiert erfolgen. Bewältigen die Systeme Routineaufgaben, injizieren fast ausschließlich Autosampler die Proben und übernehmen zusätzlich noch die Probenvorbereitung.

ProbenvorbereitungVerschiedene Autosampler bieten die Möglichkeit zur Probenvorbereitung an. Dazu gehören das automatisierte Verdünnen und Mischen der Probe und die Vorsäulenderivatisierung. Mit der geeigneten HPLC-Software verdünnen die Geräte hoch konzentrierte Proben automatisch, sodass nach nur wenigen Injektionen die höchste Analysengenauigkeit erreicht und eine Überladung der Säule verhindert wird. Liegt die Konzentration außerhalb des kalibrierten Bereiches, werden diese Over-Range-Proben ebenfalls verdünnt, sodass ein erneutes Analysieren entfällt. Um die Analysenzeiten zu verkürzen, arbeiten einige Geräte mit der Sample-Overlap-Funktion. Während eine Probe noch aufgetrennt wird, erfolgt bei der nächsten schon die Vorbereitung. Das Mischen mit einem internen Standard, die Zugabe von Reagenzien oder das Herstellen von Standardlösungen und Kalibrierungen sind weitere Funktionen, die Autosampler bieten können. Die Möglichkeit zum Thermostatisieren hat besondere Bedeutung bei der GC. Hier muss die Temperatur exakt eingehalten werden, da Schwankungen die Ergebnisse verfälschen können.Vor dem Auftrennen der Substanzgemische werden häufig nicht detektierbare Probenbestandteile im Rahmen einer chemischen Reaktion so modifiziert, dass sie sich nach der chromatographischen Trennung nachweisen lassen. Reaktionen, die vor der Säulentrennung erfolgen, bezeichnet man als Vorsäulenderivatisierung. Ein Beispiel hierfür ist die OPA-Derivatisierung (Orthophthal-[di]-Aldehyd) zum Nachweis von Aminosäuren. Dies ist eine Technik, die schnell Ergebnisse liefert und im Vergleich zur Umsetzung mit Ninhydrin hoch empfindlich ist, allerdings nur primäre Aminogruppen erkennt. Bei dieser Methode koppelt man vor der Auftrennung die Aminosäuren mit dem Fluoreszenzfarbstoff OPA. Nach der Auftrennung lassen sich dann die Aminosäuren mit einem Fluoreszenzdetektor nachweisen. OPA-Analysatoren und Fluoreszenzmarker wie OPA, FMOC oder Dansyl-Cl führen verschiedene Unternehmen, z.B. Knauer, in ihrem Produktportfolio. „In der Probenvorbereitung ist die OPA-Derivatisierung eine Methode, die seit Jahren von entscheidender Bedeutung für die Aminosäureanalytik ist. Sie zeichnet sich durch kurze Arbeitszyklen und hohe Sensitivität aus. Mithilfe kommerziell erhältlicher Kits können verschiedene Autosampler diese Arbeitsschritte ohne manuellen Eingriff vollständig durchführen“ ergänzt Dr. Markus Fuchs, Leiter des Produktmanagements Aminosäureanalytik, HPLC und Kopplungstechniken der Wissenschaftlichen Gerätebau Dr. Ing. Herbert Knauer GmbH.ProbeninjektionDie Probenaufgabe stellt hohe Ansprüche an die Autosampler. Die Geräte müssen definierte Probenvolumina reproduzierbar in das Trennsystem einbringen, ohne die mobile Phase zu unterbrechen. Sie sollten für hohe Drücke geeignet, chemikalienbeständig und biokompatibel sein. In der HPLC werden die Proben hauptsächlich mit Dosierschleifen auf die Säule aufgebracht. Mit unterschiedlich großen Probenschleifen können die meisten Autosampler Volumina im Bereich von wenigen Mikrolitern bis zu einigen Millilitern injizieren. Die Geräte unterstützen in der Regel drei unterschiedliche Injektionsmethoden. Bei der Full-Loop-Injektion füllt die Probe die Probenschleife komplett aus. Diese Methode ist mit hoher Reproduzierbarkeit verbunden. Die Partial-Loop Injektion arbeitet mit einer partiell gefüllten Probenschleife. Das Probenvolumen ist hierbei frei wählbar. Im Mikroliter-pick-up-Modus, der bei sehr geringen Probenmengen Anwendung findet, wird eine definierte Probenmenge mit mobiler Phase als Transportflüssigkeit in die Probenschleife gegeben, sodass die Probenmenge vollständig erhalten bleibt.In der GC existieren mehrere Möglichkeiten zur Probenaufgabe. Bei der Split/Splitless-Injektion durchsticht der Autosampler mit einer Spritze ein Septum und injiziert die Probe in einen Verdampfungsraum. Bei der On-Column-Methode wird die Spritzenkanüle direkt bis zur Trennsäule geführt. Die Probe erreicht die Säule in flüssiger Form und wird erst dort verdampft. Häufig ist eine Probe nicht vollständig verdampfbar, sodass eine direkte GC-Injektion nicht möglich ist. Um diese Probenarten zu analysieren oder das Zersetzen einer Probe zu verhindern, existieren unterschiedliche Verfahren. Ein Beispiel im Bereich der Probenvorbereitung ist die Headspace-Technik. Die komplette Probe befindet sich dabei in einem gasdicht verschlossenen Probenröhrchen, in dem sich ein Gleichgewicht zwischen Gasraum und Probe einstellt. Der Autosampler entnimmt die Probe aus dem oberen Dampfraum, sodass nur das Gas injiziert wird. GerätelösungenAutosampler werden als Stand-alone-Lösung oder als Bestandteil komplexer Systeme angeboten. Der nachfolgende Überblick zeigt eine Auswahl an derzeit verfügbaren Geräten (ohne Anspruch auf Vollständigkeit). Die beschriebenen Eigenschaften sind exemplarisch ausgewählt und gelten auch für andere Systeme.Smartline Autosampler 3900Der Smartline Autosampler 3900 von Knauer ist ein kostengünstiger Allrounder für unterschiedliche Applikationen in der Routineanalytik (s. Abb. 1). Ausgestattet mit einem thermostatisierbaren Säulenfach kann das Gerät vom Mischen bis zur Vorsäulenderivatisierung alle wichtigen Probenabarbeitungs- und Vorbereitungsschritte übernehmen. Der Anwender kann zwischen den drei Injektionsmodi, volle Schleifenfüllung, Teilschleifenfüllung, und Mikroliter-pick-up wählen. Insgesamt drei Reagenzpositionen, davon zwei unabhängige, erlauben vielfältige Anwendungsmöglichkeiten. Eine selektierbare Injektionsnadelspülung verhindert Probenverschleppung. Optional kann das System mit einer Probenkühlung ausgestattet oder für biokompatible und präparative Anwendungen umgerüstet werden. Autosampler 717plusDer kompakte Autosampler 717plus von Waters verbindet hohe Zuverlässigkeit mit geringen Kosten. Das vollautomatische Gerät kann Schritte zur Probenvorbereitung wie Derivatisieren, Verdünnen oder die Zugabe von Referenzstandard-Lösungen durchführen und mithilfe des optionalen Heiz- und Kühlmoduls z.B. hitzelabile Proben abarbeiten. Die automatische Standarderstellung und Rekalibrierung ergänzen die Programmiermöglichkeiten. Der Probengeber, der sich in allen gängigen HPLC-Systemen integrieren lässt, ist für analytische bis semipräparative Anwendungen einsetzbar.ProStar 410, 420 und 430Varian bietet in der ProStar HPLC Produktlinie drei Autosampler an. Beim ProStar 410 erfolgt die Injektion über eine Doppelnadel. Nachdem die äußere Nadel das Septum des Vials durchstochen hat, taucht die innere Nadel in die Probe ein und fördert das Probenvolumen. Das PAS-System (pressure assisted sampling) erzeugt einen Überdruck im Probengefäß und ermöglicht so die präzise Probennahme. Auch der ProStar 420 nutzt das Doppelnadelprinzip, die innere Fördernadel kann jedoch aus unterschiedlichen Materialen bestehen. Mit der flexiblen Peek-Nadel ist die Probennahme bis auf den Vialboden möglich. Der ProStar 430 verfügt über dieselbe Injektionstechnik wie der ProStar 420, verwendet aber Mikrotiterplatten (96 Well, 384 Well, Deep und Low Well). ProStar 420 und 430 können mit Schaltventilen zur Eluenten- und Säulenschaltung ausgestattet sein. Alle drei Autosampler bieten umfangreiche Mischfunktionen. Dabei kann eine Probe z.B. mit einem Derivatisierungsagens oder einem internen Standard dotiert werden. Die Autosampler sind mit Kühlung und in biokompatibler Ausstattung erhältlich.BasicMarathon, Midas, Endurance und TriathlonSunChrom bietet mit BasicMarathon, Midas, Endurance und Triathlon vier Autosampler an. Das Grundmodell BasicMarathon wird z.B. in der Routinekontrolle eingesetzt. Der Midas enthält als zusätzliches Element eine Säulenthermostatisierung und ist mit einer Nadel mit seitlicher Öffnung ausgestattet, um ein Verstopfen zu verhindern. Auch der Triathlon nutzt eine Extranadel zum Durchstoßen der Septa. Endurance arbeitet mit allen gängigen Mikrotiterplatten und ist u.a. für die Mikro- und Nano-HPLC vorgesehen.PerkinElmer 200Die 200-Serie von PerkinElmer ist ein Universalgerät und für einen hohen Probendurchsatz in kurzer Zeit ausgelegt. Mit einer Kapazität von bis zu 768 Proben und zwei bis drei Injektionen pro Minute eignet sich das Gerät u.a. für Mikrobore-HPLC und LC/MS-Applikationen. Um mehrere Mikrotiterplatten abarbeiten zu können, lässt sich der Probengeber mit dem Twister Mikrotiterplatten Stapelautomat kombinieren. Ein programmierbarer XYZ-Roboter sorgt für die erforderliche Präzision. Wie die meisten Autosampler können die Geräte der 200-Serie als Stand-alone-Gerät oder angeschlossen an eine Workstation oder Client-Server-Lösung arbeiten.SIL HAT und SIL-20A/ACDie beiden Autosampler SIL HAT und SIL-20A/AC von Shimadzu zeichnen sich durch hohe Injektionsgeschwindigkeit aus und sind besonders für die Fast-HPLC oder LC-MS/MS geeignet (s. Abb. 2). Für eine 10 ml-Injektion benötigen die Geräte 15 bzw. 10 Sekunden. Die Kapazität liegt bei bis zu 350 Probengefäßen bzw. vier 384- Well-Mikrotiterplatten im SIL-HT. Ein Rack-Changer kann die Probenkapazität des SIL-20A auf insgesamt zwölf Mikrotiterplatten ausdehnen. Beide Geräte arbeiten nach dem Direktinjektionsprinzip. Als Teil der Probenschleife bleibt die Nadel nach der Injektion in der Flusslinie. So kommt es zu keinem Probenverlust, da nur das auf die Säule zu injizierende Volumen benötigt wird. Eine spezielle Beschichtung der Nadel minimiert die Gefahr der Probenverschleppung. Zudem existieren Spülmodi, die ein Verschleppen weiter vermindern sollen. So kann der SIL-20A/AC mit einer zweiten Spülpumpe ausgestattet werden, um mehrere Spülvarianten durchführen zu können. Mit Autosamplern von CTC und Thermo im Sortiment kann Axel Semrau auf individuelle Anforderungen des Kunden eingehen. Die Autosampler sind sehr flexibel und eignen sich für anspruchsvolle und komplexe Applikationen (s. Abb. 3). Aufgrund der modularen Bauweise können die frei programmierbaren Geräte unterschiedlichste Aufgaben erfüllen und bei steigenden Ansprüchen mitwachsen. So lassen sich die Geräte z.B. für die Probenvorbereitung bei Headspace- oder SPME-Techniken einsetzen. Die intuitive Software, mit der auch ein kompletter Ablauf programmiert werden kann, ermöglicht eine einfache Bedienung und schnelle Integration in andere Systeme.GC/MS und LC/MSDie Gefahr des Carry Over bzw. des Verschleppens einer Verunreinigung von Probe zu Probe ist bei der Kombination mit gekoppelten Geräten besonders zu beachten. Massenspektrometer sind so empfindlich, dass bereits geringste Verunreinigungen das Messergebnis verfälschen können. Um Verunreinigungen zu vermeiden, verfügen Autosampler häufig über spezielle Optionen zum Waschen und Reinigen der Probenschleife und Nadel. Neben den Waschprozeduren wurden auch die Oberflächen der verwendeten Materialien den gewachsenen Anforderungen angepasst. Teilweise werden Injektionsnadeln und Dichtungen verwendet, die chemisch inert sind, um Carry-Over-Effekte zu verhindern.„Eine besondere Herausforderung stellen unpolare und basische Substanzen dar. Um diese Stoffe rückstandsfrei entfernen zu können, sind möglichst inerte Oberflächen und effektive Waschprozeduren erforderlich. In Abhängigkeit der jeweiligen Applikation empfiehlt sich in einigen Fällen sogar eine zweite Spülflüssigkeit,“ ergänzt Regina Römling, Produktspezialistin HPLC und Datensysteme, Shimadzu Europa.Die Autosampler von CTC, die auch von Axel Semrau oder Gerstel vertrieben werden, sind häufig Bestandteil von Kopplungssystemen. Sie sind für gehobene Ansprüche ausgelegt und eignen sich für spezielle Anforderungen. Modulare SystemeDie Autosampler von Agilent und Dionex gehören zu modular aufgebauten Gerätefamilien.Zu der 1200-Serie von Agilent Technologies gehören mehrere Autosampler. Mit einem Fokus auf Präzision, Zuverlässigkeit und hohem Probendurchsatz umfasst das Angebot Lösungen von der Standard HPLC bis zu anspruchsvollen Hochdurchsatzanalysen. So ist das Basismodell für hohes Probenaufkommen und Probeninjektionsgeschwindigkeiten ausgelegt. Das Gerät akzeptiert alle gängigen Probengefäße wie Racks, Fläschchen, Eppendorf-Tubes und Mikrotiterplatten mit bis zu 384 Wells. Der High-Performance-Autosampler SL wurde für das Rapid-Resolution-System von Agilent entwickelt (s. Abb. 4). Speziell für die Kapillar- und Nano-LC hat Agilent den Mikro-Well-Plate-Autosampler im Sortiment. Das System sorgt für eine hohe Auflösung und erlaubt Probenvolumina im Nanoliter-Bereich. Für die präparative LC existieren zwei Systeme, die sich durch hohe Flussrate und schnelle Injektion großer Probenvolumina auszeichnen.Der WPS3000SL von Dionex ist Bestandteil des UltiMate 3000 HPLC-Systems. Die Injektion erfolgt nach dem Split-Loop-Prinzip. Die Probennadel ist Bestandteil der Probenschleife, sodass mit weniger als 15 Sekunden sehr kurze Injektionszeiten realisierbar sind. Der eingebaute Wash-Port ermöglicht ein automatisiertes Purgen der Pumpe durch die Probennadel. Der WPS3000 wiederum arbeitet nach dem Pulled-Loop-Prinzip und gehört zum UltiMate 3000 NanoLC-System (s. Abb. 5). Dieses Gerät enthält eine Edelstahlnadel zum Durchstechen des Septums und eine zweite flexible Nadel zur Probenentnahme, mit der auch geringe Probenmengen direkt vom Boden des Probengefäßes aufgenommen werden können. Sowohl der WPS3000 für die Nano/Cap/Mikro-LC als auch der WPS3000SL verfügen über die Möglichkeit, neben den Standard-Injektionsroutinen die Probenvorbereitung und Injektion frei zu programmieren. Die AS- und AS50-Autosampler gehören zu den Dionex-Ionenchromatographie-Systemen und arbeiten ebenfalls nach dem Pulled-Loop-Prinzip.Der Überblick zeigt, dass der Markt an Autosamplern sehr umfangreich ist und sich für jede individuelle Anforderung und die verschiedensten Applikationen das passende Gerät finden lässt.*Der Autor ist redaktioneller Mitarbeiter bei LaborPraxisE-Mail: o.spoerkel@labsciences.de

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