Einführung in die zentrifugale Partitionschromatographie Chromatographie mit der Zentrifuge

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Es muss nicht immer die gepackte HPLC-Säule sein. Auch ganz ohne feste Phase ist chromatographische Stofftrennung möglich. Wir erklären, was es mit der zentrifugalen Partitionschromatographie auf sich hat und warum sie von Vorteil sein kann.

Bei Chromatographie denken viele an die klassische Säulenchromatographie, bei der eine flüssige Phase (Lösungsmittel) durch eine feste Phase (silika-gepackte Säule) geführt wird. Das Zweiphasensystem auf fester stationärer Phase und flüssiger mobiler Phase bietet den Vorteil, dass die gepackten Säulen sich nahezu beliebig spezialisieren lassen und vorgefertigte Lösungen für fast jede Trennaufgabe existieren. Doch es muss nicht immer eine Festphasenchromatographie sein. In einigen Fällen stellt die zentrifugale Partitionschromatographie (Centrifugal Partition Chromatography, CPC) eine sinnvolle Alternative dar – und sie kommt ganz ohne herkömmliche feste Trägerstoffe aus. Das präparative Aufreinigungsverfahren ist auch als Gegenstromchromatographie (Countercurrent chromatography, CCC) bekannt und zielt darauf ab, die größtmögliche Menge eines bestimmten Moleküls in höchster Reinheit zu isolieren, und zwar in kürzester Zeit und eben ohne Verwendung von silika-basierten Säulen oder Medien. Nichtsdestotrotz haben die CPC und präparative HPLC einige Ähnlichkeiten:

• Die Ziele der Methoden sind die gleichen: Produktaufreinigung durch Stofftrennung

• Der grundlegende chromatographische Prozess ist identisch: unterschiedliche Wechselwirkung der Analyt-Moleküle mit den verschiedenen Phasen des Systems.

• Und auch bei den Peripheriegeräten finden sich viele Gemeinsamkeiten: Pumpen, Injektoren, in Reihe geschaltete Detektoren und Fraktionssammler.

Chromatographie ohne feste Phase

Der grundlegende Unterschied zwischen Flüssigchromatographie (LC) wie Flash oder HPLC und Partitionschromatographie ist die Art der stationären Phase. Bei der klassischen LC besteht die stationäre Phase aus beschichtetem oder unbeschichtetem Siliziumdioxid, wobei das Gerüst der Partikel nur als Träger dient und die Oberflächenchemie die chemischen Wechselwirkungen mit der mobilen Phase und den zu trennenden Verbindungen erzeugt. Die stationäre Phase ist dabei fest in das Herzstück des LC-Systems integriert: die Trennsäule.

Die CPC benötigt keinen festen Träger wie Siliziumdioxid, sondern funktioniert mit zwei nicht mischbaren flüssigen Phasen. Die eine dient als mobile Phase oder Eluent und die andere als stationäre Phase. Der technische Trick, mit dem das Flüssig-Flüssig-System funktioniert, ist eine mit verschlungenen Kanälen durchsetzte Drehscheibe. Darin wird die stationäre flüssige Phase durch ein Zentrifugalfeld festgehalten. Die Affinität der gelösten Stoffe in den beiden Phasen kann durch ihren Verteilungskoeffizienten (Kd) gemessen werden. Je größer die Affinität zur stationären Phase, desto später eluiert ein Analyt – genau wie bei der klassischen Säulenchromatographie.

Stofftrennung mit dem gewissen Dreh

Sehen wir uns den Aufbau einer CPC im Vergleich zu einer gepackten Säule genauer an. Klassische LC-Säulen sind einfach aufgebaut: ein Zylinder (Edelstahl in der HPLC- und Kunststoff oder Glas in der Flash-Chromatographie) mit einem Einlass und einem Auslass an jedem Ende, gefüllt mit einer festen stationären Phase, meist Kieselerde. Die CPC-Säule hat ebenfalls einen Ein- und Auslass für die mobile Phase, aber hier enden die Ähnlichkeiten mit einer HPLC-Säule auch schon. Um eine Phase des biphasischen Systems in der Säule zu halten, werden ein Zentrifugalfeld und speziell entwickelte CPC-Scheiben verwendet. Die CPC-Säule besteht aus einer Reihe von CPC-Scheiben, die auf einem Rotor angeordnet sind, (Abb. 2, links). Der Rotor beginnt sich zu drehen, um die Zentrifugalkraft zu erzeugen, die die stationäre Phase zurückhält. Die Scheiben setzen sich aus einer Reihe von Zellen zusammen, die miteinander durch einen dünnen Kanal verbunden sind (Abb. 2, rechts). Eine CPC-Säule besteht aus über tausend Zellen mit einem Drehverschluss an jedem Ende, um die drehende Säule mit dem Pumpensystem, dem Detektor und anderen Systemkomponenten zu verbinden.

Über ein Ventil lässt sich die Flussrichtung ändern. Daher arbeitet das CPC-System entweder im aufsteigenden Modus (Abb. 3), bei dem die leichteste Phase die mobile Phase ist, oder im absteigenden Modus, bei dem die schwerste Phase die mobile Phase ist. Dies ermöglicht sowohl normale und umgekehrte Modi, ohne dass die Säule ausgetauscht werden muss.

Trennleistung als Verteilungsfrage

Der chromatographische Effekt bei CPC hängt von der Verteilungskonstante (oder dem Verteilungsverhältnis, K_d) ab. Dies ist die Gleichgewichtskonstante für die Verteilung eines Analyten in zwei nicht mischbaren Lösungsmitteln. Für eine bestimmte Verbindung gilt: sie gleicht dem Verhältnis ihrer molaren Konzentration in der stationären Phase zu ihrer molaren Konzentration in der mobilen Phase gemäß der Gleichung K_d= [a]stationäre Phase / [a]mobile Phase.

Ein K_d-Wert von 1 bedeutet eine gleichmäßige Verteilung zwischen der mobilen und der stationären Phase. Um eine CPC-Trennung durchzuführen, sollte der Wert zwischen 0,5 und 5 liegen. Ist der K_d-Wert zu niedrig (unter 0,5), wird der Analyt in der mobilen Phase zurückgehalten und es findet keine Trennung statt; ist er zu hoch (über 5), wird der Analyt in der stationären Phase zurückgehalten.

Das Lösungsmittelsystem kann dann anhand der Verteilungskoeffizienten aller Moleküle, die getrennt werden müssen, bestimmt werden.

Was sind die Vorteile einer CPC?

Nachdem wir nun wissen, wie eine CPC-Einheit aufgebaut ist, kommen wir zu der entscheidenden Frage: Was sind die Vorteile der zentrifugalen Partitionschromatographie? Das verfügbare Volumen der stationären Phase und das Fehlen von Siliziumdioxid macht die Technik in mancherlei Hinsicht besser als herkömmliche Trennverfahren:

• keine Säule muss ersetzt und kein Siliziumdioxid recycelt werden

• geringer Lösungsmittelverbrauch (z. T. über 400-mal weniger Lösemittel pro Lauf als bei HPLC)

• hohe Durchflussrate bei geringer Laufzeit (weniger Stromverbrauch, und Arbeitszeit)

• hohe Leistung, hohe Reinheit und hohe Rückgewinnung

• kein Probenverlust (keine irreversible Proben­absorption oder Denaturierung von empfindlichen Molekülen)

• umfangreicher Anwendungsbereich – von Naturprodukten, ätherischen Ölen, Cannabinoiden und Erdölextrakten bis hin zu Proteinen – ohne dafür andere Säulen nehmen zu müssen

Darüber hinaus gibt es keine unerwünschten sekundären Wechselwirkungen mit Silanolen auf dem Sili­ziumdioxid, weshalb diese Technik die Integrität empfindlicher Verbindungen bewahrt, ohne dass es zu Denaturierungen oder einem Verlust durch irreversible Adsorption kommt. CPC ist eine praktikable Alternative zur klassischen LC-Aufreinigung mit hohem Beladungspotenzial und – abgesehen vom Lösungsmittel – ohne laufende Kosten.

* R. Carano, Field Instrumentation Sales and Support Specialist, Gilson International

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