Computerunterstützte Methodenentwicklung in der HPLC

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Molnár-Institute for applied Chromatography

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Eine weitere Voraussetzung für den Routineeinsatz der Hochtemperatur-HPLC ist die Temperaturstabilität der stationären Phase. Zurzeit sind nur wenige Trennsäulen kommerziell verfügbar, die eine hinreichende Temperaturstabilität besitzen. Neben den schon seit vielen Jahren kommerziell verfügbaren metalloxidischen Trennsäulen auf Basis von Titan- oder Zirkoniumdioxid stehen nun auch Hybridmaterialien auf Basis von Siliziumdioxid zur Verfügung, die aufgrund ihrer sehr guten Temperaturstabilität bei hohen Temperaturen über 100 °C eingesetzt werden können [12, 13]. Besonders hervorzuheben ist z.B. die Temperatur- und pH-Stabilität der Waters-BEH-Materialien.

Es stellt sich nun die Frage, warum die Anwendung von Temperaturgradienten in der Flüssigchromatographie notwendig ist. Wie bereits anfangs erwähnt, basieren eine Reihe neuer Kopplungstechniken auf der Verwendung einer rein wässrigen mobilen Phase. Um eine Elution aller in einer Probe enthaltenen Substanzen zu ermöglichen, muss die Elutionskraft der mobilen Phase während des chromatographischen Laufes erhöht werden. Da keine Lösemittelgradientenelution angewendet werden kann, ist die einzige Möglichkeit die Temperaturgradientenelution. Bislang war es jedoch mit keiner Software möglich, das Retentionsverhalten der Analyten in Abhängigkeit eines Temperaturgradienten in der Flüssigchromatographie zu modellieren. Jedoch konnte die Arbeitsgruppe Snyder zeigen, dass das Linear-Solvent-Strength-Modell (LSS) erfolgreich auf programmierte Temperaturgradienten in der Gaschromatographie (GC) angepasst und angewendet werden konnte [14]. Dieses Modell, das als Linear-Elution-Strength-Modell (LES) bezeichnet wurde, soll nun auf Temperaturgradienten in der Flüssigchromatographie angewendet werden.

Ergebnisse und Diskussion

Im Gegensatz zur HPLC erfolgt die Elution in der GC ausschließlich im Temperaturgradientenmodus. Dabei ist zu beachten, dass die Änderung der Temperatur in der GC aufgrund der geringen Innendurchmesser der verwendeten Trennsäulen unmittelbar wirkt. In der LC ist nun vorstellbar, dass aufgrund der üblicherweise verwendeten Trennsäulen mit einem Innendurchmesser zwischen 2,1 und 4,6 mm die am Heizsystem eingestellte Temperatur das Säulenbett mit einer gewissen Verzögerung erreicht. Der Grund dafür ist die Ausbildung von radialen Temperaturgradienten. Wird also ein Heizsystem verwendet, bei dem die programmierte Temperatur nicht der tatsächlichen Temperatur in der Trennsäule entspricht, wie dies z.B. häufig bei konventionellen Luftöfen ohne Eluentenvorheizung der Fall ist, ist im Rahmen der Retentionsmodellierung der Analyten eine temperaturabhängige Verzögerungszeit zu berücksichtigen. Um diese zu ermitteln, wäre es sinnvoll, direkt die tatsächliche Temperatur in der Mitte des Säulenbettes zu messen. Dies ist jedoch in einem Hochdrucksystem bei Temperaturen von bis zu 200 °C experimentell nur schwer zu realisieren. Die Evaluierung, ob eine temperaturabhängige Verzögerungszeit berücksichtigt werden muss, kann auch über die Simulation von Temperaturgradienten erfolgen. Dazu wurde ein Gemisch aus sechs Steroiden verwendet. Die Messungen der Temperaturgradienten mit einer rein wässrigen mobilen Phase wurden auf zwei Zirchrom-PBD-Trennsäulen mit unterschiedlichen Innendurchmessern durchgeführt (Zirchrom-PBD, 150 x 3 mm, 5 µm; Zirchrom-PBD, 100 x 1 mm, 3 µm). Bei diesen Materialien handelt es sich um Zirkoniumdioxid, das mit Polybutadien beschichtet ist. Für die Basismessungen wurde ein Temperaturbereich von 60 bis 160 °C gewählt und Temperaturgradienten mit Steigungen von 1,5, 3,0, 4,0 und 6,0 °C/min angewendet.

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