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Den Rand-Effekt in zellbasierten Assays minimieren

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Minimierung des Edge Effects – Zellkulturplatten im Vergleich

Im Folgenden wird eine einfache und zweckmäßige Methode zur Minimierung der Verdunstung durch die Nutzung des äußeren Grabens und des Raumes zwischen den Wells der Eppendorf 96-Well-Zellkulturplatte beschrieben. Dieser Beitrag vergleicht Eppendorf 96-Well-Zellkulturplatten mit 96-Well-Zellkulturplatten anderer Hersteller in Bezug auf Well-zu-Well-Variation und Verdunstung.

  • Vorbereitung der Platten: Zur Beurteilung der Verdunstung in 96-Well-Platten wurden die Eppendorf-Zellkulturplatte sowie drei weitere Wettbewebsplatten untersucht. Der äußere Graben der Eppendorf-Platte wurde mit 1 x 5 mL PBS befüllt. Der innere Raum zwischen den Wells wurde mit 1 x 8 mL PBS befüllt. Die Platte des Herstellers A bietet einen Graben mit vier Reservoirs, die mit Flüssigkeit befüllt werden können. 1,75 mL PBS wurden in jedes der vier Reservoirs gegeben. Die Platten wurden in einem Eppendorf New Brunswick CO2-Inkubator bei 37 °C, 5 % CO2 und entsprechender Luftfeuchtigkeit äquilibriert. Da die Platten der Hersteller B und C keine Möglichkeit bieten, den Raum zwischen den Wells zu befüllen, wurden für diese Platten keinerlei Vorbereitungsschritte durchgeführt.
  • Verdunstungsmessungen: Nach der Äquilibrierung wurde jede Platte unter Benutzung des automatischen Pipettiersystems ep-Motion 5075m mit 200 µL sterilen Wassers pro Well befüllt. Die Platten wurden unter Standardbedingungen (37 °C, 5% CO2, befeuchtete Atmosphäre) inkubiert. Nach fünf Tagen Inkubationszeit wurden die Platten aus dem Inkubator entnommen und für 30 Minuten bei Raumtemperatur äquilibriert. 0,01 %-Kristallviolettlösung wurde zugegeben (20 µL/Well) und durch Resuspendieren vermischt. Daraufhin wurden 100 µL dieser Mischung aus jedem Well in eine Eppendorf Microplate (VIS 96/F) gegeben. Für die Erstellung einer Kalibrierungskurve wurden Kristallviolett-Standards hergestellt. Die Absorption der Proben und der Standards wurde bei 600 nm im Eppendorf Platereader AF2200 gemessen. Dargestellt sind die Mittelwerte aus zwei Messungen.

Flüssigkeitsverluste über die gesamte Platte minimieren

Bei längeren Inkubationszeiten wird das Phänomen der Verdunstung in 96-Well-Platten zu einem kritischen Faktor. Insbesondere in Rand-Wells tritt Flüssigkeitsverlust auf, da diese Wells nicht vollständig von benachbarten Wells umgeben sind. Das Isolieren der Rand-Wells mit Flüssigkeit kann die Verdunstung reduzieren, wie in Tabelle 1 dargestellt. Ohne Isolierung zeigen die äußeren Wells der Eppendorf 96-Well-Zellkulturplatte nach fünftägiger Inkubation unter Zellkultur-Standardbedingungen eine durchschnittliche Verdunstung von nur 1,8 %. Der geringe Flüssigkeitsverlust ist wahrscheinlich auf die optimierte Passgenauigkeit von Deckel und Platte zurückzuführen. Das Befüllen des äußeren Grabens mit Flüssigkeit senkt die Verdunstungsrate auf weniger als 1 %. Wie in Abbildung 1 gezeigt, ermöglicht das „Chimney-Well“-Design der Eppendorf-Platte das zusätzliche Befüllen des Well-Zwischenraumes, was die Verdunstung in den Rand-Wells auf lediglich 0,3 % senkt. Ein weiterer Vorteil der Isolierung jedes einzelnen Wells ist eine langsamere Abkühlung des Mediums in den Wells wenn die Platte außerhalb des Inkubators gehandhabt wird (z.B. beim Mikroskopieren). Jede Flüssigkeit, wie steriles PBS, Wasser oder Zellkulturmedium, eignet sich zum Befüllen des Grabens und des Zwischenraumes. Durch die Konstruktion der Eppendorf-Zellkulturplatte lässt sich der komplette Zwischenraum mit nur einem Pipettierschritt befüllen.

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Ein Vergleich verschiedener 96-Well-Zellkulturplatten (s. Abb. 2 und Tabelle 2) zeigt, dass die Eppendorf-Zellkulturplatte die einzige Platte ist, welche die Verdunstung effektiv minimiert. Hersteller A bietet die Möglichkeit einer teilweisen Isolierung der äußeren Wells; allerdings konnte hier nach wie vor ein deutlicher Randeffekt beobachtet werden, wenn auch abgeschwächter, im Vergleich zu Herstellern B und C.

Das Befüllen des gesamten Well-Zwischenraumes der Eppendorf-Zellkulturplatte trägt zu einer homogenen Feuchtigkeitsverteilung und Temperaturstabilität innerhalb der Platte bei. Dies führt zu einer verminderten Verdunstungs- und Kondensationsrate, was den Edge Effect drastisch reduziert.

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