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Assays Den Rand-Effekt in zellbasierten Assays minimieren

| Autor / Redakteur: Jessica Wagener* und Christelle Plennevaux** / Dr. Ilka Ottleben

Der so genannte Edge Effect ist gefürchtet, da er die Ergebnisse zellbasierter Assays beeinträchtigt. Eine neue Zellkulturplatte bietet nun zwei Optionen, die äußeren sowie die inneren Wells zu isolieren, was eine gleichmäßige Verteilung von Temperatur und Feuchtigkeit gewährleistet.

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Abb. 1: ...B) Isolierung aller 96 Wells durch Befüllung des gesamten Zwischenraumes
Abb. 1: ...B) Isolierung aller 96 Wells durch Befüllung des gesamten Zwischenraumes
(Bild. Eppendorf)

Die Analyse zellulärer Reaktionen mithilfe zellbasierter Assays gewinnt in nahezu allen Bereichen der biologischen Forschung an Bedeutung. Die Möglichkeit, Assays an Hochdurchsatzverfahren anzupassen, macht diese unentbehrlich. So werden sie z.B. in der pharmazeutischen Forschung eingesetzt, um potenzielle Medikamente zu identifizieren. Die Aussagekraft und der Wert der erhaltenen Daten beruhen auf der gleichbleibend hohen Qualität der durchgeführten Assays. Zahlreiche Gründe können zur Unbeständigkeit in Multi-Well-Platten beitragen, so z.B. Variationen in Zellaussaat und Unterschiede in Zellwachstum und -adhärenz. Einige dieser Aspekte können durch die Optimierung von Routineverfahren im Labor vermieden werden. Mögliche Maßnahmen schließen adäquate Durchmischung und Dissoziierung der Zellen ein, das Vermeiden von Luftblasen während der Zellaussaat sowie die Bestimmung optimaler Wachstumsbedingungen bezüglich der Medienzusammensetzung und Aussaatdichte. Der so genannte Edge Effect kann durch diese Maßnahmen allerdings nur selten vermieden werden. Da Well-zu-Well-Variationen in Assay-Ergebnissen vor allem in den äußeren Wells einer Multi-Well-Platte eine Rolle spielen, wird dieses Phänomen als Randeffekt („Edge Effect“) bezeichnet.

Die Ursachen des Edge Effects sind vielfältig. Temperaturunterschiede innerhalb der Platte und Verdunstungseffekte in den Rand-Wells während der Inkubation wurden als zwei mögliche Faktoren beschrieben, die unregelmäßiges Zellwachstum insbesondere an der Peripherie der Platte zur Folge haben können [1;2]. Es wird allgemein angenommen, dass Verdunstung in den äußeren Wells zu einer Anreicherung von Medienkomponenten (z.B. Salzen) führt, was wiederum den Zellstoffwechsel beeinflusst. Temperaturgradienten können ungleichmäßige zelluläre Reaktionen hervorrufen. Beide Faktoren – Verdunstung und Temperaturgradient – können zu Unregelmäßigkeiten führen sowie zu höheren Varianzen zwischen individuellen Assays, und somit letztendlich zu unzuverlässigen Ergebnissen.

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Methoden zur Vermeidung des Edge Effects

Verschiedene Methoden zur Vermeidung des Edge Effects wurden bereits beschrieben. Ein Ansatz, um die Auswirkungen eines Temperturgradienten zu minimieren, ist die Vorinkubation der Platte mit frisch ausgesäten Zellen für ein bis zwei Stunden bei Raumtemperatur, wodurch gleichmäßigere Zellverteilung und Adhäsion erreicht werden [3]. Allerdings kann sich diese Methode, abhängig vom Zelltyp, auf die Lebensfähigkeit der Zellen auswirken. Für Anwendungen, bei denen langfristige Inkubationen vonnöten sind, stehen verschiedene Produkte, wie Feuchtigkeitskammern und Temperaturkammern, von verschiedenen Anbietern zur Auswahl. Ihr Zweck ist die Erschaffung einer gleichbleibenden Mikroumgebung, indem die Verdunstung reduziert und ein nahezu konstantes Niveau an Feuchtigkeit und Temperatur erreicht wird.

Eine weitere gängige Methode zur Verhinderung des Edge Effects stellt die Vermeidung der peripheren Wells dar, dies allerdings auf Kosten des Probendurchsatzes und der Effizienz. Das Nichtbenutzen der äußeren Wells einer 96-Well-Platte reduziert die Anzahl der verfügbaren Wells auf 60, eine Verminderung des Plattendurchsatzes um 38 %. Dies resultiert in höheren Ausgaben für Einmalartikel, beansprucht mehr Platz im Inkubator und kostet Zeit.

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