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Next Generation Sequencing Die Auswahl des richtigen Laborwassers für Sequenzierungen

Autor / Redakteur: Estelle Riché* und Sean P. Kennedy** / Dr. Ilka Ottleben

Next Generation Sequencing (NGS) ist in aller Munde. Ehrgeizige Projekte wollen mithilfe dieser nächsten Generation der DNA-Sequenzierungstechnologie innerhalb kurzer Zeiten komplette Genome entschlüsseln. Doch die beste Technik kann keine zuverlässigen Ergebnisse liefern, wenn die Grundlagen nicht stimmen.

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Abb. 1: Grundprinzip der Laborwasseraufbereitung
Abb. 1: Grundprinzip der Laborwasseraufbereitung
(Bild: Merck Millipore)

Hochwertige Reagenzien sind unerlässlich für Labore, die Next Generation Sequencing (NGS) durchführen. Um die Qualität und Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, bemühen sich NGS-Labore sehr, Kits, Protokolle, Reagenzien und Verfahren zu standardisieren. Dennoch wird Wasser, ein grundlegendes Reagenz im NGS-Arbeitsablauf, oftmals übersehen und sollte in diese rigorose Qualitätskontrolle einbezogen werden. Die Qualität des Wassers hat einen direkten Einfluss auf die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit von Sequenzierergebnissen. Von der Systemreinigung bis hin zur Sequenzierung erfordern verschiedene Aktivitäten im NGS-Arbeitsablauf unterschiedliche Wasserqualitäten. Ein eingehendes Verständnis der verschiedenen Wasserverunreinigungen und deren potenziellen Einflüsse auf die Sequenzierergebnisse erleichtern es Laboren, das beste Wasser für ihre jeweiligen Anforderungen aus dem breiten Angebot an Wasserqualitäten zu wählen.

Die höchste Wasserqualität, die allgemein in Laboren verwendet wird, ist „Reinstwasser“ (s. Abb. 1). Es sollte stets für sehr empfindliche Anwendungen eingesetzt werden, einschließlich der Zubereitung von Reagenzien und Puffern für die Sequenzierung. „Reinwasser“ kann für allgemeine Laboranwendungen und zum Spülen eingesetzt werden.

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Verunreinigungen beeinflussen Versuchsergebnisse

Wasser kann viele Verunreinigungen enthalten, einschließlich Ionen (beispielsweise Magnesium und Eisen), organische Stoffe (beispielsweise Huminsäuren), Bakterien und deren Abbauprodukte (beispielsweise Nukleasen), Partikel und Gase. Selbst wenn viele dieser Verunreinigungen nur in sehr geringen Mengen vorliegen, können sie doch einen direkten Einfluss auf DNA- oder Enzym-Reaktionen haben, die bei der Sequenzierung stattfinden. Außerdem können Verunreinigungen wie Partikel oder Bakterien Geräte kontaminieren oder sich in den Leitungen von Liquid Handlern absetzen. Die Wasserqualität für jeden Schritt des NGS muss daher sorgfältig ausgewählt werden (s. Abb. 2).

Schritt 1 – Erstellung einer Nukleinsäure-Bibliothek

Die Erstellung hochwertiger Sequenzierbibliotheken aus Nukleinsäuren ist ein kritischer Schritt, um zuverlässige NGS-Daten zu erhalten. Wenn zur DNA-Fragmentierung ein automatischer Ultraschall-Homogenisator eingesetzt wird, sollte Reinwasser für das Wasserbad verwendet werden, da Verunreinigungen die Effizienz der Übertragung präziser Amplituden auf die Probe beeinträchtigen könnten. Zur Quantifizierung und Qualitätskontrolle der Bibliothek kann Gel-, Chip- oder Kapillar-Elektrophorese eingesetzt werden. In allen Fällen hängt die ladungsbedingte Wanderung der Probe von der Wasserqualität ab. Bei der Kapillar-Elektrophorese arbeiten die Geräte außerdem mit Fluoreszenzdetektion, die durch organische Verunreinigungen beeinträchtigt werden kann. Die Verwendung von Reinstwasser für die Zubereitung von Puffern und Kapillargel sowie für Verdünnungen gewährleistet daher zuverlässige Ergebnisse. Bei der Vorbereitung von Proben für das Next Generation Sequencing (beispielsweise PCR, Ligation, DNA-End-Reparatur) finden außerdem viele enzymatische Reaktionen statt, die alle von der Wasserqualität abhängig sind.

Schritt 2 – Fluoreszenz-basiertes NGS

Der Sequenzierprozess ist äußerst empfindlich gegenüber jeglicher Nukleaseaktivität. Wenn beispielsweise die Solid-Sequenziermethode (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) angewendet wird, dauert ein typischer Lauf mit etwa zwei Millionen Basenpaaren fünf bis sieben Tage. Auch wenn der Einfluss einer DNase-Kontamination während der anfänglichen Lade- und Kalibrierphase ggf. nicht offensichtlich ist, kann eine Signalverschlechterung im Laufe einer Woche verheerende Folgen für die Versuchsergebnisse haben. Aus diesem Grund sollte für alle Pufferverdünnungen und alle Gerätepuffer nur nukleasefreies Reinstwasser verwendet werden.

Nukleasen spalten die Phosphodiesterbindungen von Nukleinsäuren. Diese robusten Enzyme sind überall in der Laborumgebung vorhanden und bekanntlich schwer zu beseitigen. Autoklavieren reicht nicht aus, um Nukleasen aus Laborwasser zu entfernen. Auch wenn Nukleasen bei diesem Prozess ggf. denaturiert werden, können sie ihre native Struktur und Funktion wiedererlangen. In vielen Fällen wird das Wasser zunächst chemisch mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandelt und danach autoklaviert, um die Inaktivierung der Nukleasen zu gewährleisten. Das Problem bei dieser Methode ist, dass der Alkohol und das CO2, die bei dieser chemischen Behandlung erzeugt werden, mit enzymatischen Reaktionen Wechselwirkungen eingehen und somit die Versuchsergebnisse beeinträchtigen können. Außerdem ist DEPC eine gefährliche Chemikalie und die DEPC-Behandlung ist langwierig.

Eine alternative Methode zur DEPC-Behandlung von Wasser ist die Ultrafiltration. Dieser Prozess setzt Hohlfasern ein, um Verunreinigungen nach ihrer Größe zu trennen. Dabei werden Nukleasen nicht einfach inaktiviert, sondern letztendlich ganz aus dem Wasser entfernt. Ein Ultrafilter (Biopak, Merck Millipore, s. Abb. 4) kann an der Entnahmestelle eines Wasseraufbereitungssystems angeschlossen werden. Reinstwasser, das durch Ultrafiltration behandelt wurde, ist nukleasefrei. Die Wirksamkeit der RNase-Entfernung durch Ultrafiltration entspricht der RNase-Inaktivierung durch DEPC-Behandlung, jedoch ohne die Nachteile, die durch die Erzeugung von Alkohol und CO2 entstehen. Die Ergebnisse einer vergleichenden Untersuchung zur Wirksamkeit der RNase-Entfernung sind in Abbildung 3 dargestellt.

Schritt 3 – Ionen-Halbleiter-Sequenzierplattformen

Die Ion-Torrent-Sequenziertechnologie (Thermo Fisher Scientific) misst den Einbau von Nukleotiden anhand von pH-Änderungen. Diese Technologie ist empfindlich gegenüber allen pH-Änderungen, die nicht auf der Erweiterung des DNA-Moleküls beruhen, wie beispielsweise durch Kontamination, Temperaturänderungen und/oder atmosphärisches CO2 in den Prozesslösungen. Ein Lauf von ~100 Millionen Basenpaaren dauert weniger als sechs Stunden. Im Benutzerhandbuch ist angegeben, dass Lösungen täglich mit Reinstwasser (Widerstand: 18 MOhm·cm) direkt aus einem Wasseraufbereitungssystem anzusetzen sind und dass das Wasser nicht gelagert werden darf.

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