Drogenwirkstoffe schnell aus Blut und Urin extrahieren

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Gerstel GmbH & Co. KG

SIM Scientific Instruments Manufacturer GmbH

a1-envirosciences GmbH

Die Handhabung ist einfach: Der Probenteller des MPS wird von Hand mit den DPX-Pipettenspitzen bestückt. Die Zugabe von Lösemitteln erfolgt über eine Flüssigmikroliterspritze. Abhängig von der jeweiligen Anwendung wird das Sorbens mit einem geeigneten Lösemittel konditioniert. Das geschieht durch Aufziehen aus einer Vorlage (Vial) oder durch Einspritzen. Die Probenflüssigkeit wird in definierter Menge aufgezogen, wobei sie folgerichtig mit der Pipettenspitze in Berührung kommt, nicht aber mit der Nadel der Mikroliterspritze. „Es gibt keine Cross-Kontaminationen und Verschleppungen“, sagt Ralf Bremer, bei Gerstel als Geschäftsführer für Forschung und Entwicklung sowie die Produktion verantwortlich, und merkt an, dass Strömungsführung und Durchflussrate bei dispersiven SPE-Techniken keinen Einfluss auf deren Extraktionsleistung haben. Aus dem Probenvial entfernt, zieht die Spritze Luft durch die aufgenommene Probe. Die Aliquote werden sprudelnd durchmischt, was die Anreicherung der Analyten auf dem Sorbensmaterial beschleunigt. Die Probenflüssigkeit wird aus der Pipettenspitze in einen Abfallbehälter geleert, dann folgen der Waschschritt sowie die Elution der Analyten mit einem geeigneten Lösemittel in ein vorbereitetes Vial. Die Pipettenspitze wird verworfen, und der MPS ist bereit für die nächste Probe. Die Probe muss anschließend nicht wie bei einer manuellen Vorgehensweise unter Schutzgas eingedampft und der Rückstand mit einem tauglichen Lösemittel aufgenommen werden, sondern kann über die vollautomatisierte DPX als Large-Volume-Injektion (LVI) in das GC/MS aufgegeben werden. Das Lösemittel wird verdampft und die Analyten unmittelbar im GC-Eingangsliner angereichert. Das erfordert den Einsatz eines geeigneten temperaturprogrammierbaren Split/splitless-Injektors, etwa den des Gerstel-Kalt-Aufgabe-Systems KAS.

Von der Theorie in die Praxis

Mit dem Ziel, die Effizienz der GC/MS-Analyse von Drogen und deren Metaboliten in Blut und Urin zu steigern, griffen die Applikateure von Gerstel auf die DPX-Technologie zurück. Die Anwendung machte es notwendig, jede einzelne Probe zeitnah zur Analyse zu präparieren: Die Probenaufgabe sollte genau in dem Moment erfolgen, in dem das GC/MS-System nach dem Abschluss eines GC-Laufs wieder bereit ist für die Aufgabe der Probe. Diese Verschachtelung von Probenvorbereitung und -aufgabe wurde mithilfe der Maestro-Steuersoftware mit Prep-Ahead-Funktion realisiert.

Um ihr MPS-DPX-KAS-GC/MS-System in der Praxis zu testen, dotierten und analysierten die Gerstel-Applikateure Blut- und Urinproben mit unterschiedlichen Drogenwirkstoffen und Medikamenten. Die Bandbreite der untersuchten Stoffe erstreckte sich von Amphetaminen und Benzodiazepinen über Kokain und Methadon bis Tetrahydrocannabinol und seinen Metaboliten (s. Abb. 3-5). Die Analyse erfolgte unter Einsatz deuterierter interner Standards. Für die Blutproben wurde D5-PCP (0,2 ppm) eingesetzt, für die Bestimmung der Benzodiazepine kamen d5-Nordiazepam (0,2 ppm) und d5-OH-Alprazolam (0,2 ppm) zum Einsatz; für die Opiate verwendete man die deuterierte analoge Verbindung (jeweils 0,1 ppm).

Zur Aufbereitung der Blutproben wurden 0,25 mL einer Vollblutprobe mit 0,5 mL Acetonitril versetzt, gemixt und so die Proteine ausgefällt. Die Probe wurde zentrifugiert und der Überstand in saubere und etikettierte Röhrchen überführt, von denen jedes 0,1 mL einer 0,1 M Salzsäure (HCl) enthielt. Zur Aufbereitung der Urinproben für die Bestimmung von Benzodiazepinen bedarf es zum Teil einer Hydrolyse der jeweiligen Konjugate. Eingeleitet wurde die Hydrolyse-Reaktion durch Zugabe von 10 µL des Enzyms ß-Glucuronidase und 50 µL 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 4 in je 0,2 mL der Urinproben. Sie wurden dann für die Dauer von zwei Stunden auf 55 °C gehalten, auf Raumtemperatur abgekühlt und zur Fällung des Enzyms mit 0,25 mL Acetonitril versetzt. Nach Zentrifugieren der Lösungen wurde der Überstand in saubere und etikettierte Probenröhrchen überführt. Jede Probe wurde mit 200 µL einer 0,1 M Salzsäure versetzt und anschließend in das Probentray des MPS 2 gestellt.

Disposable Pipette Extraction (DPX)

Für die DPX, automatisiert auf dem Multi Purpose Sampler MPS, wurden so genannte 1-mL-DPX-CX-Spitzen von DPX Labs verwendet. Diese enthalten als neu entwickeltes Sorbens einen Kationenaustauscher mit zusätzlichen unpolaren Eigenschaften. 250 µL einer 30-prozentigen Acetonitril-Wasser-Lösung wurden auf das DPX-Sorbens dispensiert. Die DPX-Spitze tauchte in die Probenlösung, eine definierte Menge Probenflüssigkeit wurde aufgezogen. Mittels eingezogener Luft wurde die Probe mit dem Sorbens gut durchmischt. Nach 30 Sekunden, in der sich die Analyten auf dem Sorbens angereichert und ein stabiles Gleichgewicht erreicht hatten, wurde die Probenlösung in den Abfall dispensiert. Das Sorbens wurde zunächst mit 0,5 mL der 30-prozentigen Acetonitril-Wasser-Lösung, dann mit 0,5 mL reinem Acetonitril gewaschen. Die Elution der Analyten erfolgte unter Einsatz von 0,7 mL einer Lösung bestehend aus zwei Prozent Ammoniumhydroxid, 78 Prozent Dichlormethan und 20 Prozent Isopropanol. Das Eluat wurde direkt in vorher gekennzeichnete GC-Vials dispensiert. Die Gesamtzeit für Extraktion und Flüssigkeitshandling betrug je Probe nur sechs Minuten. Alle Schritte verlaufen automatisiert, während die jeweils vorherige Probe analysiert wird.

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