English China
Suchen

LC-NMR Effiziente Strukturaufklärung von Naturstoffen mit LC-NMR

Autor / Redakteur: Markus Godejohann*, Cristina Daolio*, Li-Hong Tseng* und Lea Heintz* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Die Strukturaufklärung bislang unbekannter Naturstoffe ist bedingt durch den notwendigen Aufreinigungschritt sehr arbeits- und zeitintensiv. Lesen Sie, wie eine neue Methode, die auf einer automatisierten Nachsäulen-Festphasenanreicherung zur Substanzisolierung beruht, eine schnelle und effiziente Aufklärung von Strukturen möglich macht.

Firmen zum Thema

Abb. 1: Schematische Darstellung des verwendeten LC-SPE-NMR/MS-Systems.
Abb. 1: Schematische Darstellung des verwendeten LC-SPE-NMR/MS-Systems.
( Bild: Bruker Biospin )

Üblicherweise erfolgt die Strukturaufklärung unbekannter Naturstoffe mittels Massen- und Kernresonanzspektroskopie (NMR) nach mehrstufiger chromatographischer Auftrennung der Rohextrakte. Hierbei werden für die NMR-Untersuchung die chromatographischen Peaks mithilfe eines Fraktionssammlers aufgefangen, vom Laufmittel befreit, in deuteriertem Lösemittel gelöst und schließlich vermessen. Insbesondere bei der Entfernung der mobilen Phase nach der Fraktionsammlung ergeben sich häufig Probleme: Zum einen werden die bei der Trennung verwendeten Puffer und Salze mit angereichert, zum anderen konzentrieren sich die im Laufmittel enthaltenen Verunreinigungen auf. Dies kann im ersten Fall bis zum Abbau der aufgereinigten Verbindung führen, im zweiten Fall sind die NMR-Resonanzen der gesuchten Verbindung nicht mehr von denen der Verunreinigungen zu unterscheiden. Aus diesen Gründen eignet sich die Methode nur für stabile Haupt- und Nebenkomponenten in Naturstoffextrakten.

Alternative: Nachsäulenanreicherung an Festphasenmaterialien

Eine effiziente Alternative stellt die Kopplung der Chromatographie mit hochauflösender NMR und die Nachsäulen-Festphasenextraktion (post column-SPE) mit anschließender Elution der getrockneten SPE-Kartuschen in die NMR dar (s. Kasten „Post-column-SPE-NMR“). Im Gegensatz zur traditionellen LC-NMR-Technik, bei der anstelle von Wasser teures Deuteriumoxid verwendet wird, kann die LC-SPE-NMR-Kopplung mit protonierten Lösemitteln durchgeführt werden. Hierdurch ist insbesondere der unerwünschte H-D-Austausch von aziden Protonen im Massenspektrum der unbekannten Verbindung ausgeschlossen, der unweigerlich zur falschen Massenbestimmung führen würde.

Bildergalerie

Wird ein hochauflösendes Massenspektrometer über einen Splitter in die Kopplung integriert, kann die exakte Masse und somit die Summenformel der unbekannten Komponente bestimmt werden. Ist das hochauflösende Massenspektrometer mit einem zusätzlichen Quadrupol-Massenfilter zur Isolation sowie einer Kollisionszelle ausgestattet, ist es zudem möglich, neben Full-scan-MS-Daten auch die in der Kollisionszelle produzierten Fragmente der unbekannten Verbindungen exakt zu vermessen. Auf diese Weise ergeben sich weitere wichtige strukturelle Informationen bereits während der Anreicherung der Analyten auf den SPE-Kartuschen.

Beispiel: Strukturaufklärung eines Naturstoffs in Apfelsaft

Die mittel- bis unpolaren Inhaltsstoffe des Apfelsaftes wurden mittels klassischer Off-line-Festphasenextraktion an Polystyrol-Divinylbenzol-Kopolymer um den Faktor vier angereichert. Der Vorteil dieser Probenvorbereitung liegt in der Abreicherung von sehr polaren Verbindungen wie Zuckern oder kurzkettigen Säuren, die eine schnelle Kontamination der Ionenquelle des Massenspektrometers bewirken, wenn der Saft direkt injiziert werden würde. Der so gewonnene Extrakt wird anschließend auf eine analytische HPLC-Säule injiziert. Nach der Auftrennung wird selektiv eine nach 22 Minuten eluierende unbekannte Nebenkomponente auf der SPE-Kartusche post column angereichert (s. Abb. 2). Die selektive Anreicherung des Peaks mit m/z 569,188 Th erfolgt dabei durch massenseletive Detektion.

(ID:318659)